漫談力學生物學

細胞是生命最小的單位，了解細胞的運作一方面是滿足人類對於生命如何運作的好奇，另一方面提供疾病治療的線索，因為許多疾病的來源是來自於細胞失去正常的運作。傳統上，生物學家在研究細胞，著重在基因、化學物質對於細胞的影響，忽略各種物理因素對於細胞的影響。到了二十一世紀，科學家已經確定物理因素會影響細胞維持生理功能。例如細胞需要施力才能維持正確的細胞形狀或者移動，身體裡的細胞承受著各種外力，例如血流、肌肉收縮、重力，維持健康的生理反應，觸覺、聽覺都是力學刺激，細胞對於這些力學刺激有適當的訊號傳遞，維持正常的功能，失去適當的力學刺激或者失去對於力學刺激的訊號傳導都會造成疾病[1]。例如太空人在沒有承受重力下，一個月可流失1% 的骨頭，得到骨質疏鬆症，骨質疏鬆症在老化的社會中是是現今流行病學的一大問題，目前並沒有藥能治癒這個病。血管硬化是跟不穩定的血流形態造成不正常的剪應力，影響了內皮細胞的表現。如果細胞對於力訊號傳導過程出錯，會造成疾病，例如有一些癌症，有些耳聾就是耳朵內的毛細胞，無法將聲音的力學訊號傳遞出去，還有一些跟力傳導相關的蛋白質突變也都會造成疾病。生命發生時，受精卵所需的資訊都儲存在基因內，但是在整個胚胎發育的過程中，細胞的成長、移動、與鄰居細胞的相互推擠都會反饋到細胞內，有些反饋能導致細胞分化成不同功能的細胞，最後變成一個個體，現在科學家相信細胞所處的力學環境影響整個發育的過程。

力學生物學（Mechanobiology，或者翻成機械生物學）是近二十年迅速興起的新領域，著重在探討力對於細胞或組織的影響，更明確的課題例如如何接收外界力學微環境的訊息並作出反應，或者細胞如何使用力進行生理行為，例如移動。這個領域跟生物力學（biomechanics）有些不同但也有部分是重疊，生物力學著重在生物系統的機械結構與力學行為，力學生物學更強調的是找出與細胞作用力相關分子機制還有找出與力相關訊號傳遞，受力學影響的生理功能。雖然力學生物學是這二十年來的新興領域，但是整個概念在1917 年D’arcy Thompson 的書‘on growth and form’ 裡面就提到動物植物的形狀受力的影響，就很像肥皂泡泡形狀受到表面張力影響。但是當時的科學研究的技術，無法回答Thompson 提出的問題。五零年代發現癌細胞能長在軟洋菜膠上[2]，不需要貼附在基材上，但是正常的附著型細胞就需要有地方抓才生存的下來。這個發現對於癌症研究是很重要的工具。七零年代生物學家更近一步的去找出細胞抓著細胞外間質的細胞器官是黏著斑（focal adhesions），八零年代左右，在哈佛兒童醫院的Judah Folkman 醫師研究指出細胞形狀和生長的關係，細胞攤得越開，長得越快[3]。差不多同時期在北卡大學的Albert Harris 將細胞長在薄薄的矽膠膜上，矽膠模會因為細胞施力變皺，顯示細胞貼在基板上是靠著細胞抓力拉住基板的[4]。

哈佛大學的Donald Ingber 受到Judah Folkman 研究的啟發，想要更精確控制細胞的形狀來影響細胞的生長[5]，他的博士班學生Christopher Chen 用George Whitesides 實驗室發展出的微壓印技術，就是用軟蝕刻做出二甲基矽氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）印章，然後將纖連蛋白轉印在基板上的，所以細胞形狀可以是直徑10 μm 的圓形或者長度是20 微米的正方形，他們發現當20 微米以下的圓形圖案時，細胞會死掉。可以附著的面積越大，細胞活得越好[6]。Donald Ingber 實驗室做出這實驗時， 我還是個在做軟物質物理的博士班學生，那時有鼓勵物理科學的研究人員轉做生物研究的潮流，舉辦了許多跨領域的研討會，我和 David Weitz 實驗室的人一起去參加在美國國家衛生院的一個研討會，當時我對生物一竅不通，看到Donald Ingber 顯示他的實驗室能把細胞養成正方形，我覺得還蠻酷的，可是對於很多生物學家，看習慣細胞各種肆意攤開的形狀，看到一個正方形的細胞可能覺得很不自然很反感，在會中提出嚴厲的批評，雙方激辯起來，讓我印象深刻的是Donald Ingber 辯到最後最後說，”I am a professor from Harvard, not from a la la land.” 我覺得非常有趣，當一個新的主意被提出時，即使是哈佛教授也是會被攻擊的很厲害，還是要捍衛自己的想法。二十一世紀許多研究把細胞長成三角形、星形、花瓣形等各種形狀，可能很難想像二十多年前這個主意被視為非常瘋狂，難以接受。除了貼附細胞的力學，同時間在西岸錢煦院士，開啟了許多在血管流體力學的研究，他的研究顯示壓力和流速會對血管內皮細胞造成影響。 

九零年代許多尖端的物理學的工具例如光鎳子（optical tweezers）、原子力顯微鏡（atomic force microscopy）、應用在生物領域的研究，這些工具讓生物物理學家可以測量生物分子的“ 機械性質”，例如延展生物高分子時所需的力、分子馬達如肌凝蛋白（myosin）的力量、或者聚化肌動蛋白（actin）時會產生的力量，這些分子層級的研究，有助於建立模型了解細胞內的現象。同一時間，螢光顯微術也有很大的進步，綠色螢光蛋白讓生物學家可以觀察細胞內特定分子的運動，商業化共軛焦顯微鏡普及和雙光子顯微鏡的誕生，科學家能直接觀察個別或群體細胞的移動時，內部分子的移動，尤其是細胞骨架（cytoskeleton）相關的蛋白質。在九零年代末很重要的發展就是當時在麻州大學汪育理院士實驗室有系統的顯示將細胞養在有彈性的聚丙烯醯胺的水膠上，細胞的形態和移動會受這個水膠的軟硬度影響[7]。而因為基材有彈性，所以可以透過測量基材的形變，測量細胞的抓力，汪育理實驗室也發展了細胞牽引力顯微術（Traction Force Microscopy）（圖一）[8]，Harris 的工作雖然顯示細胞對機材有抓力，但是那個測量並不是精確定量的測量，而細胞牽引力顯微術的測量可以更精確的測量力的大小。細胞牽引力顯微術讓科學家能將細胞在時間上與空間上的變化與細胞如何施力結合起來了解，促進對於力對於細胞功能的了解是重要工具。

圖一：細胞牽引力測量的示意圖。在彈性基材中包埋螢光粒子（綠色），受拉扯後會有形變，螢光粒子移動到紅色位置。實驗中可以測量出這個位移量，最後反推出細胞的拉力。

在2006 年賓州大學的Dennis Discher 實驗室發表了一個突破性的研究，他們將幹細胞養在不同硬度的聚丙烯醯胺膠上，在很軟的膠上，幹細胞分化成神經細胞，在很硬的膠上，幹細胞分化成骨骼細胞，在接近肌肉組織硬度的膠上，幹細胞分化成肌肉細胞，幹細胞的分化會受還基材軟硬度的調控 [9（] 圖二A）。這篇文章至今已經被引用14000 次以上，而我個人認為整個領域的升起與這篇文章出現很有關連。而略早之前，同在賓州大學的 Christopher Chen 也發表一篇文章，顯示可以靠控制細胞形狀來控制幹細胞分化[10]（圖二B），這兩個工作都清楚顯示改變物理因子是可以調控細胞。幹細胞分化是提供細胞治療、組織工程中很重要的題目，這幾篇文章的出現，讓許多作組織工程的人對這個方法產生興趣，而製作不同軟硬度的水膠材料是就是跑蛋白質電泳的材料，幾乎所有生物實驗室都會有，微壓印技術不需要無塵室，實驗方法相對容易，所以許多人就加入這個在不同軟硬度或者形狀上養細胞的行列了。

圖二：物理因子影響幹細胞的命運。（A）幹細胞在軟基材會分化成神經細胞，在硬基材會分化成成骨細胞，在中間的硬度會分化成肌肉細胞。（B）細胞面積可以控制幹細胞分化成脂肪細胞和成骨細胞的傾向，細胞面積越大，越容易分化成成骨細胞。

細胞如何偵測軟硬度並且有相對應的生理變化？生物學家很努力的在找尋細胞內決定性的” 力傳導分子”，那個分子在受力的狀態下，會改變形狀，影響訊號傳導途徑作出變化。我們如何知道一個物品的軟硬度？我們會用去壓或捏該物品，所以我們需要接觸物品與施力在物品上，手就能感測物品的硬度。根據這個邏輯，細胞貼附在基板上是透過黏著斑（focal adhesion）與由外界相連的跨膜受體接合蛋（integrin）和許多其他蛋白質的組成，黏著斑與肌動蛋白纖維相連，肌動蛋白纖維（actin filament，F-actin）上有分子馬達肌凝蛋白，肌凝蛋白會產生拉力透過肌動蛋白纖維將力傳遞到外部，或者在細胞內造成張力。許多研究顯示黏著斑這個組成是動態的，會跟黏著斑受力大小，或者黏著斑成熟的程度相關。裡面有些蛋白質是對力敏感的，會因為拉力而改變自己的型態，改變與另外一個蛋白質的結合，有些不是。肌動肌凝蛋白纖維本身會出力，他出力的大小，或者在黏著點附近造成基材的形變跟基材的軟硬度相關，的型態也會受力調節而改變型態，例如變成很粗的應力纖維（stress fiber），肌動蛋白絲的分解會跟他受力的狀態相關，當他沒有張力，肌動蛋白的分解酶就能快速地將肌動蛋白分解[11] （圖三）。整個黏著斑與肌動蛋白的變化都與力相關，最後如何變成生物訊號，導致細胞有不同的行為，還是沒有完全的解答。但是了解這些黏著斑的生成、分解、肌動蛋白的聚合，科學家成功的解釋了透過接合蛋白的細胞遷移，基本上可以想成四個步驟：

一、靠著細胞前端肌動蛋白聚合讓細胞產生
突出的偽足。
二、偽足伸出後黏著斑產生。
三、細胞往前移動。
四、尾端的黏著斑溶解。
反覆這四個步驟，細胞就能遷移（圖四A）。值得一提的是要能解釋激動蛋白聚合能產生足夠的推力讓細胞前端能產生突出的偽足，是透過George Oster 提出的布朗棘輪模型解釋 [12（] 圖四 B）。

圖三：研究顯示當肌動蛋白纖維在光鑷子與肌凝蛋白施加拉力下，不容易被切絲蛋白分解。

圖四：細胞遷移機制的示意圖。（A）1. 細胞前端因為肌動蛋白聚合而有突出。2. 偽足伸出後黏著斑產生。3. 細胞往前移動。4. 尾端的黏著斑溶解。（B）布朗棘輪模型解釋肌動蛋白聚合時能推動細胞前端的細胞膜，產生偽足。

在找尋細胞內的” 力傳導蛋白質”，在很早的時候，還沒有力學生物學這個領域時，神經學家就提出應該有因受力而改變型態的離子通道，尤其在那些需要感謝機械訊號的神經，例如觸覺神經、聽覺神經，這類離子通道能將機械力轉成電訊號傳遞到不同細胞，2021 年的諾貝爾生理獎就是頒給發現機械敏感性離子通道（piezo）。細胞內除了許多蛋白質會因為力改變形狀，還有一些細胞胞器也是對力很敏感的。例如細胞核是細胞內最大的胞器，過去十年發現細胞核會透過細胞骨架與接合蛋白與細胞間質連結，力會對細胞核造成的影響有細胞核上的蛋白質形狀改變，轉錄激活因子進出細胞核的改變，還有染色體在細胞核裡的分佈改變。其中一個很重要的發現是YAP 這個轉錄激活因子，當YAP 進入細胞核內，幹細胞就會分化成骨骼細胞，而研究發現細胞核受力的話，細胞核上核孔就會打開（圖五），這個研究為軟硬度如何影響幹細胞分化，提出了一個解釋[13]。現在有越來越多研究顯示其他胞器例如內質網、粒線體也都會受力的影響而改變型態，而這些胞器的變化，又會改變細胞內部的化學或者生物分子的濃度，可能又會反饋到肌動蛋白絲的力學狀態，這些觀察顯示研究力學細胞學的困難，就是細胞外在環境會影響細胞內部，而細胞內部又會去影響外在環境，要解這個因果關係，找出真正影響訊號傳導的上游的因子，或者在繁複的這些訊號傳導路徑中，找出最重要的關鍵，而最後細胞會變化成什麼型態，最終訊號是傳遞到細胞核表達出蛋白，所以細胞的力學環境是否影響著細胞核內染色體的結構，造成不同的表觀基因，這都是這個領域現在的挑戰。

圖五：基材軟硬度影響YAP 進出細胞核示意圖。左圖是軟基材情形，細胞沒有受力。右圖是在硬基材下，細胞拉力會透過肌動蛋白纖維施加壓力在細胞核上，造成細胞核孔打開，YAP 更容易進去細胞核內，啟動細胞增生與骨分化的訊號傳遞。

從物理學家的角度來看整個力學細胞研究是非常吸引人的，這是個非平衡系統，越來越多量化的測量，是一個跨尺度的系統內含有力學系統、化學反應和隨機過程，要深入瞭解需要透過理論模型的建立，現在終於有機會物理學家能了解一個生命系統就像我們之前了解非生命系統一樣徹底。例如大部分的細胞在越硬的基材上，攤得越開，有一些研究把細胞攤開用軟物質科學中的濕潤現象（wetting transition）模型來解釋[14]，就是細胞表面與基材的短距離作用力，細胞表面有些糖分子造成排斥力還有細胞本身的彈性力，這些力的總合來決定細胞的形狀，但是在細胞中，這些力往往不是常數，還有許多測量的技術進步，所以這類的模型最後比較是定性的描述，而無法與實驗數據直接相比。除此之外，有些細胞並沒有因為硬度高而攤得開，例如皮質神經元細胞在軟的基材上伸展的比較開[15]，或者有些細胞的攤開跟界面的黏著蛋白質很有關連，這可能跟細胞內部的蛋白質組成有關。所以要做到對細胞在基材上攤開的了解，如同軟物質中我們能描述濕潤現象，還有許多研究工作要做，現在科學家開始能進行這類型的研究，但是要進行這類研究並不容易，得到量化的數據往往不是靠個儀器就測量得到，細胞與細胞之間的差異性又大，能到統計上有足夠的量，需要很多次的重複與時間，對於做實驗的人員細胞樣品的準備需要有細胞培養的訓練，測量的部分還要有足夠物理科學的訓練，所以人才養成也不易，而論文引用次數可能不如生醫材料類文章的引用次數，但是必須要有這類的研究繼續深入探討，才有機會深入用物理的原理來了解生命系統的運作。研究機構、研究資助機構在審核計畫時必須要能有鑑別力判斷深入、基礎且重要的研究，而不是只看文章數目或者刊物的影響因子，有洞見的支持深入整合物理與生物的研究題目，才能有突破性的發現。

幹細胞能透過外在物理條件來誘導分化，這是醫學工程學上的進步，但是仍夠不夠，目前對於幹細胞的分化，還是無法完全的掌控，這也反映出我們對於細胞內部如何運作，還是不夠瞭解。例如要做出可以用的組織，需要將細胞培養在三維環境，但是細胞維度這個機械條件的反應，科學家了解的很少，有研究指出，在三維環境下細胞對於硬度的反應與二維並不一致，所以在三維中探索力學細胞學有兩層意義，一個是檢測目前在二維上得到的解釋，是否能解釋三維中的觀察，這樣有助於剖析維度對於細胞的影響來自於哪一個因素？另一個是找出更接近體內的培養環境，這樣狀況下的細胞表現才接近於體內，能用作篩藥的平台。用人工培養環境代替動物實驗已經變成要執行的政策，如果使用動物做藥物篩檢的門檻又更高，而現有二維細胞方法對於藥物的預測能力不佳，找出更適合藥物篩檢的實驗室培養細胞方法是克不容緩的挑戰。這個領域很大，發展很快，這篇文章是從我個人這十年進入這個領域後從物理學家的角度來省視，很多研究無法提及或者細部的解釋，但希望能引起大家對這個領域的興趣與重視，我相信在未來的Molecular Biology of Cell 這本書，將會有一個章節是關於力學對細胞的影響。

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