單分子振動光譜技術在澱粉樣低聚物結構研究的應用

  • 物理專文
  • 撰文者：周家復、Leonardo Lesser-Rojas、吳荷芙 (Katrin H. P. Vu)、薄杰海 (Gerhard H. Blankenburg)
  • 發文日期：2023-05-08
  • 點閱次數：863
Print   PDF

一、引言

纖維狀胜肽和蛋白質聚集體的形成及其在細胞內和細胞周圍的沉積現象，是許多神經退行性和代謝性疾病的表徵，其範圍從阿茲海默症和帕金森氏症到第二型糖尿病及透析相關之類澱粉沉積症或澱粉樣變（amyloidosis， 是澱粉樣蛋白（amyloid）， 一種異常蛋白質，沈積在組織所引起的疾病）[1]。那些所謂的澱粉樣蛋白原纖維在結構上由垂直於原纖維長軸（交叉 β 結構）延伸的 β 鏈定義（圖一c）。在聚集過程中，這些胜肽進行結構重組，形成稱為低聚物（oligomers）的亞穩態中間物種，低聚物進一步自組裝成原纖維，最終形成成熟原纖維，如圖一a 所示。越來越多的證據表明，表現出更高細胞毒性的不是成熟原纖維，而是寡聚中間體（oligomeric intermediates）[2-4]。此外，許多研究發現金屬離子，如銅二價離子（Cu2+）、鋅二價離子（Zn2+）或鐵三價離子（Fe3+），可以改變澱粉樣蛋白的聚集路徑[5-8]。例如，有研究指出，鋅二價離子可與澱粉樣蛋白−β（Aβ）胜肽結合並誘導離徑（off-pathway）寡聚體的形成，這些寡聚體最終不會形成原纖維，而是形成較大的無定形（amorphous）聚集體[9,10]。由於其和醫療保健的密切關係，了解澱粉樣蛋白病變和澱粉樣蛋白的形成，及有毒澱粉樣蛋白低聚物的特性和結構便引起了研究上極大的興趣。不過，人們對低聚物結構的研究不如成熟的纖維狀形態那麼詳細，也正是由於它們在構形和大小上的異質性、短暫性及低豐度，這些中間物種很難用傳統的結構測定方法來表徵。下一節將簡要介紹用於蛋白質結構測定的常用光譜學方法，以及它們之間的相對比較。

fig1.jpg

圖一：澱粉樣蛋白聚集示意圖。（a）循徑（On-pathway）機制：天然單體錯誤折疊並發生構形變化，形成原纖維前寡聚體（oligomers，或譯低聚物）、原纖維（protofibrils）和成熟原纖維（mature fibrils）。（b）由金屬離子誘導的替代途徑：單體形成偏離途徑（off-pathway）的寡聚體，其最終產物不是原纖維，而是無定形聚集體（amorphous aggregates）。（c）平行（parallel）和反平行（anti-parallel）交叉β 結構的示意圖。澱粉樣原纖維具有平行交叉的β 構形。

二、振動頻譜學及其他常用光譜學方法的概述和比較

振動頻譜學，如傅利葉變換紅外光譜學（FTIR）和拉曼光譜學（Raman spectroscopy），是表徵蛋白質結構的常用技術。這兩種技術提供了分子振動的互補訊息，因為弱紅外波段可能會經歷強烈的拉曼響應，反之亦然[11]，並且它們都提供了各種酰胺區域的特徵，從而揭示了有關蛋白質結構的訊息。其他廣泛用於蛋白質結構分析的頻譜學方法包括核磁共振（NMR）、熒光光譜學（FS，fluorescence spectroscopy）、紫外- 可見光譜學和圓二色性（CD）。NMR 測量改變磁場中磁核自旋排列所需的能量，這取決於原子的局部環境。FS 用光激發分子中的電子，並測量激發電子返回基態時放出的光子[12]。紫外－可見光譜學乃測量蛋白質熒光團對電磁光的吸光度[13]。

在上述頻譜學方法中，核磁共振是唯一能夠提供具有原子分辨率的結構訊息的方法。儘管如此，固態核磁共振是一種相對不敏感的技術，需要冷凍樣品。溶液核磁共振可以解析蛋白質的三維結構，並提供有關生理條件下動力學和分子間相互作用的訊息。然而，溶液核磁共振需要大量可溶形式的純樣品，這些樣品必須在室溫下穩定並且體積小。

紫外－可見光光譜學和CD 光譜學因其易於操作和快速數據分析而常用於實驗室[14]。然而，紫外－可見光譜對雜散光或光散射的干擾非常敏感，並且分辨率低且光譜峰重疊。FTIR 光譜可準確解析β 折疊的組成，這使其成為研究澱粉樣蛋白的合適技術[15]。不過，水對紅外輻射的強烈吸收限制了它在水性環境中用於生物樣品的分析。在拉曼光譜中，水帶訊號很弱，這使其可以在接近生理條件的含水環境中測量樣品。然而，由於靈敏度低，需要高樣品濃度。為了克服這個問題，大家陸續開發了可提高拉曼光譜靈敏度的策略，例如電漿子增強拉曼光譜（PERS）。後者是一個概括性術語，概括了表面增強拉曼光譜（SERS）和尖點增強拉曼光譜（TERS）的概念，包括任何利用適當奈米結構產生電漿子材料界面附近的天線效應，藉以實現高度局部化的超高拉曼信號靈敏度[16]。與傳統的塊材拉曼光譜相比，電漿子增強拉曼技術可以提供高達近14 個數量級（~ 百兆倍）的信號增強[17,18]，從而可以實現至單分子層級的結構研究。

其他常用的單分子檢測方法基於熒光光譜，例如單分子佛斯特（Förster）共振能量轉移（smFRET）和熒光相干光譜學（FCS）[19,20]。然而，熒光標記已被證實會顯著改變澱粉樣蛋白寡聚體的形成，而原纖維的結構幾乎不受影響[21]。因此，無標記技術是澱粉樣蛋白低聚物結構分析的首選。表一總結並比較了上述光譜學方法的相關特性。

box1.jpg

表一：各種光譜 / 頻譜技術之間的比較 [14,17,18,22-30]

三、澱粉樣低聚物種的綜集平均式研究

3.1 紅外光譜學
蛋白質的酰胺I 紅外波段對二級結構特徵高度敏感，但其波段高度重疊於水的紅外吸收頻譜，以致於大大的阻礙了在水性環境中的研究。克服這個問題的一種方法是用衰減全反射傅利葉變換紅外光譜學（ATRFTIR），正如Milosevic 等人最近發表的文章所使用的那樣[31]。研究雞蛋蛋白質纖維化過程中的構形變化。觀察到從水溶液轉變為90% 乙醇溶液後，紅外光譜的酰胺I 和III區域有β- 折疊的顯著變化。為了進一步提高該技術的靈敏度和選擇性，內部反射元件的表面可以用澱粉樣蛋白特異性抗體進行功能化。Gerwert 和同事[32-34] 開發了一種基於ATR-FTIR 的免疫傳感器，用於檢測和分析生理水環境中的少量Aβ 胜肽（圖二a）。在這項研究中，證明了該傳感器可以測量阿茲海默症（AD）患者腦脊液（CSF）和血漿中的Aβ 胜肽二級結構分佈。結果發現，與對照組相比，AD 患者的Aβ 胜肽的酰胺I 帶頻率（代表β- 折疊構形）發生顯著變化，因此可用作阿茲海默症的頻譜生物標記。

二維紅外（2D-IR）光譜是另一種用於區分澱粉樣蛋白結構的方法[35-37]。相對於ATRIR或其他線性紅外光譜技術，二維紅外光譜的優勢包括其對不同振動模式之間耦合的敏感性和更高的光譜分辨率。例如，Lomont 等人[35] 利用這一優勢在Aβ40 和Aβ42 原纖維中識別出1610 cm−1 處的條帶（圖二b），該條帶不會出現在富含β- 折疊的低聚物中，並且無法在線性紅外光譜中解析，因為它被澱粉樣原纖維的以1625 cm−1 為中心的寬特徵β 折疊帶所覆蓋。

fig2.jpg

圖二：（a）免疫紅外傳感器示意圖。如果標記帶（酰胺I）以無序或 α －螺旋單體亞型為主，則患者被診斷為非阿茲海默症（深藍色）。如果 β- 折疊亞型顯示富集（紅色），則酰胺I 信號移動到閾值（1642 cm−1）以下，即被診斷為有阿茲海默症。（b）Aβ42 的二維紅外光譜經聚集30 分鐘、1 天和 7 天（代表從低聚物到成熟原纖維的轉變）、基本轉變的對角線切片（虛線）和 Aβ42 的代表性TEM 圖像.1610 cm−1 躍遷在2D 光譜和對角線切割中標有星號。分別從[34] 及[35] 經許可轉載及改編的部分圖。

3.2 拉曼光譜
近年來，由於奈米結構和奈米粒子製造的進步，PERS 因其高空間分辨率和靈敏度而成為研究蛋白質結構的越來越流行的工具。該技術需要電漿子基底材料，通常通過有利的形態來增強，例如隨機粗糙的表面、單個奈米顆粒和有序的奈米結構陣列等[38]。許多研究使用金或銀奈米粒子作為電漿子材料。例如，D'Urso 等人[39] 利用銀奈米粒子的增強特性研究人類胰島類澱粉蛋白（human islet amyloid polypeptide，hIAPP）和Aβ40 低聚物在超低濃度水溶液中的自組裝過程。對酰胺I 條帶的分析表明，hIAPP 寡聚體富含β- 折疊二級結構，而Aβ40 富含α- 螺旋。另一方面，由hIAPP 和Aβ40 的混合物形成的寡聚體的光譜僅包含一個α- 螺旋肩作為二級結構。

Bhowmik 等人[40] 引入了一種模擬細胞膜的新方法，通過用脂質雙層膜包裹銀奈米顆粒來研究膜結合Aβ40 寡聚體的構形。因此，只有當低聚物穿透膜並靠近奈米顆粒表面時，才能預期表面電漿子增強拉曼（SERS）訊號的增強。因此，這些結果支持Aβ 寡聚體形成不受調節的離子通道或“ 孔”，導致神經元功能障礙和神經元死亡的假説。

在最近的一項研究中，Banchelli 等人[41]利用銀奈米線檢測不同聚合階段的Aβ42 中間體（圖三）。拉曼光譜顯示高毒性澱粉樣蛋白-β 衍生的可擴散配體（ADDL）和另一種有毒Aβ42 寡聚物（A+）之間的高度相似性，而與無毒Aβ42 寡聚物（A−）的差異很明顯（圖三c）。通過將這些結果與聚離氨酸polyLys、聚精氨酸polyArg、聚組氨酸polyHis 和聚麩胺酸polyGlu 進行比較，可以得出結論，酪胺酸（Tyr）以及離氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）殘基可能是某些低聚物特徵性“ 毒性” 分子指紋的一部分。作為可能的毒性機制，有人提出，暴露的酪胺酸殘基可能促進生物膜與錯誤折疊的低聚物的結合，而暴露的離氨酸殘基可能促進疏水低聚物在膜雙層內的插入。

fig3.jpg

圖三：（a）用於SERS 分析的銀點基板圖片顯示一滴Aβ42 溶液沉積在2 釐米大的點上。插圖：現場沉積後水滴的接觸角圖像；顯示交織在一起的銀奈米線的示例性原子力顯微鏡（AFM）圖像。（b）Aβ42 寡聚體在2 小時、24 小時、48 小時和96 小時孵化時間以及成熟原纖維（從下到上）的一系列SERS 光譜。（c）與A+（有毒）和A−（無毒）低聚物相比，ADDL 的SERS 光譜。還顯示了polyHis、polyGlu、polyArg 和polyLys 的SERS 光譜以供比較。polyLys 和/ 或polyArg 的波段描述了A+ 型低聚物和ADDL 的相關光譜特徵，用彩色框標識。圖經許可改編自[41]。

四、澱粉樣低聚物種的單分子和低拷貝數研究

在本討論中，術語“ 單分子” 指的是單個聚集體，它由許多單體單元組成。這種更大的尺度使得使用可能無法解析單個分子的技術成為可能。術語“ 低拷貝數” 是指約10個或更少的個體聚集體。這包括在這裡，因為許多實驗技術不具備區分單個分子或低拷貝數的能力，並且這種過渡機制具有單分子實驗的許多好處，正如在結語中簡要討論的那樣。紅外和拉曼光譜已被用於進行澱粉樣蛋白低聚物的單分子實驗。儘管拉曼光譜在其他單分子實驗中取得了成功，但迄今為止在紅外領域有更多關於澱粉樣蛋白低聚物的科研論文。

4.1. 紅外光譜
霍夫曼等人[42] 可能是第一個接近單分子層級的澱粉樣蛋白低聚物紅外光譜研究案例。該研究探討了澱粉樣蛋白生成模型肽的各種聚集狀態。作者能夠將某些形狀的低聚物與二級結構的差異聯繫起來。

Ruggeri 及其同事在改進的原子力顯微鏡（AFM）系統[43,44] 上使用AFM-IR（右頁圖四a），並以單分子分辨率成功研究了各種聚集狀態的澱粉樣蛋白，並使用波長可調雷射在奈米尺度上進行紅外光譜分析。紅外光脈衝的吸收是用原子力顯微鏡尖端本身以分子釋放的熱量的形式來確立的。在這個平台上，通過AFM 測量的Aβ42 的形態和彈性特性與紅外光譜中內部分子結構的特徵相匹配[45]，並可以之推斷從低聚物到纖維狀物種的轉變有顯著變化。

Feuillie 等人[46] 在存在和不存在細胞膜簡化脂質模型的情況下研究了非突變（野生型）Aβ42 和兩個突變變體。在右頁圖四b 中，顯示了設置的示意圖，以及澱粉樣原纖維和低聚物的AFM 圖以及相應的紅外光譜。比較這三種不同的樣本，作者得出結論，野生型最初參與具有不同二級結構的各種聚集途徑，隨後經歷了一個緩慢的結構重組過程，而成為成熟的原纖維。

Dou 等人[47] 在他們的AFM-IR 實驗中報導了磷脂的存在對β- 突觸核蛋白二級結構的顯著影響。利用該系統的掃描能力，創建了蛋白質聚集體的紅外吸收振幅的表面圖廓，可以將其與AFM 掃描之高度圖像相關聯（右頁圖四c）。總的來說，這項工作在以比其他人更有效的方式利用和可視化紅外光譜數據方面脫穎而出。

4.2. 拉曼光譜
近二十幾年來，PERS 的各種變體已廣泛應用於單分子研究上[16,48-53]，並有持續的進步，也更加提高了其靈敏度和準確性，以下提到的一些研究就是很好的例證。TERS將電漿子增強拉曼光譜[16] 與AFM 相結合。在關於原纖維的文獻中[54-60]，我們想強調Deckert － Gaudig 等人的工作[61]，其中以相干性的AFM 和TERS 量測獲得了高空間分辨率的胰島素原纖維的相關圖像。

在報告低聚物PERS 的少數文獻中，Bonhommeau 等人[62] 通過監測酰胺帶證明了區分Aβ42 的三種不同變體的最後階段的能力。Devitt 等人[63] 能夠根據酰胺I 和幾種氨基酸的拉曼特徵區分各種蛋白質的不同中間和最終聚集階段。

D'Andrea 等人[64] 記錄了從大腸桿菌中提取的澱粉樣蛋白低聚物的單一聚集體的TERS 光譜（如下頁圖五a 所示），實現了有毒和無毒低聚物之間的區別。關於低聚物和細胞膜之間相互作用的氨基酸構形變化的可能影響的討論，將這項研究工作與其他的研究工作區分開來。

Vu 等人使用的設置[65] 與上面討論的TERS 和IR 分析有很大不同，因為測量可以在溶液相中進行，也不需涉及AFM。相反的，一對帶有奈米間隙的鈦/ 金（Ti/Au）電極充當電漿子奈米天線，用於通過介電泳（DEP）直接在SERS 敏感區域捕獲低拷貝數或單分子的澱粉樣蛋白。在如此低的目標濃度下應用介電泳捕獲分子，即強烈表明，至少有一些在溶液相中獲取的光譜是從單個分子中記錄到的[50,66]。在含和不含二價鋅離子的情況下研究Aβ40。除了將二級結構分配給各種聚集體外，還分析了苯丙氨酸和組氨酸特徵，並討論了它們的結構含義。

fig4.jpg

圖四：（a）Aβ42 低聚物的AFM 原子力顯微鏡掃描圖和相應的紅外光譜。從[45] 經許可轉載的部分圖。（b）AFM-IR 設置示意圖（上圖）；澱粉樣原纖維和低聚物的AFM 圖以及相應的紅外光譜（下圖）。從[46]經許可轉載的部分圖。版權所有2020 Feuillie 等人。（c）各種低聚物聚集體的AFM 圖和相應的IR 線吸收圖。部分圖經[47] 許可改編。版權所有2021 美國化學學會。

五、討論

AFM-IR 的單分子分辨率被證明是研究異質中間態蛋白聚集體結構的寶貴工具。該設置可以在特定激發波長下快速掃描大面積區域。正如Dou 等人所證明的[47]，這開闢了在二維映射區域中觀察一系列具時間分辨率且令人倍感興趣之特徵訊號的可能性。然而，該平台仍有改進的空間，例如通過優化AFM-IR 中奈米天線的電漿子響應，例如PERS 及其附屬領域（相關參考文獻見上一節）。

在某些情況下，光譜分析在實驗方面沒有得到充分利用。此外，在處理像澱粉樣蛋白寡聚體這樣多變的樣本時，尤其是在與整體綜集平均值進行比較時，根據有限的數據集得出錯誤結論的可能性也存在。

fig5.jpg

圖五：（a）有毒和無毒低聚物樣品的TERS 光譜。從[64] 經許可轉載的部分圖。版權所有2018 WILEY‐VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，Weinheim。（b）上圖：奈米間隙元件工作原理的卡通圖。溶液中胜肽通過一對電極之間的間隙內的介電泳捕獲，同時測量SERS 信號（上插圖）；含和不含鋅二價離子Zn2+ 的Aβ40 聚集體的穿透式電子顯微鏡（TEM）圖像（下插圖）；下圖：在不同的孵化時間後，使用奈米間隙裝置捕獲含有和不含Zn2+ 的溶液中Aβ40 的SERS 光譜。圖經[65] 許可改編。版權所有2021 美國化學學會。

5.1. 比較各種單分子方法
本節中回顧的大部分工作都利用了高度局域化的奈米天線共振。這種技術可以將大大增強的光場聚焦在奈米級體積內，可以很容易地與其他技術結合，並使用市售光學設備進行操作。最近在IR 光譜中的應用顯示了它的巨大通用性，期望它在未來可以應用於更多種類的光學技術。AFM-IR 和TERS的主要優勢在於能夠同時研究單個分子的內部結構、外部形態和機械性能。在直接比較中，與TERS 相比，AFM-IR 的主要缺點是需要掃描光譜範圍，從而限制了記錄寬範圍光譜的採集速率。Ruggeri 等人[67] 提到了100 cm−1s−1 的掃描速率。另一方面，當應用於非常有限的光譜範圍時，AFM-IR 可以實現更高的採集率。

在本節評論的文獻中，只有Vu 等人。在准單分子狀態下測量水溶液中的振動光譜。雖然已經證明在乾燥樣品中可以檢測到二級結構特徵，但不能保證結構不會受到其他因素影響。因此，最好還是能研究溶液相中的蛋白質聚集。

開發TERS 仍有很大潛力，例如通過探索更廣泛的拉曼波段，正如Deckert － Gaudig等人所證明的那樣[61]， 通過使用AFM 設置創建基於拉曼特徵的一維或二維圖像（例如Deckert － Gaudig 和van den Akker 為原纖維所做的[55]），或通過分析拉曼光譜的延時系列，如所證明的Finot 及其同事[68,69] 和Huang等人[70]。在後一項工作中，施加介電泳力將目標引導至SERS 熱點，類似於Vu 等人。這是一種非常可靠且低破壞的捕獲技術，適用於單分子無標記PERS，因為蛋白質通常可以很容易地被這種方法捕獲。

5.2. 影響
有關該類疾病的關鍵問題，例如環境對聚集途徑或藥物效率的影響，可以通過光譜分析來評估，一如上述我們評論的文獻中所示。快速且可靠地分辨各種有毒和無毒低聚物種類以及原纖維，為潛在藥物或診斷器件的高通量篩選提供了廣闊的前景。然而，還有很大的空間可以進一步利用從此類高靈敏度實驗中獲得的光譜數據。可喜的是，在本文評論過的所有作者都勇於冒險的進入有利於醫學科學進步的方向，並面對挑戰。希望在未來，大家可以在單分子層級上對具有健康衝擊的病原體（例如澱粉樣蛋白寡聚體）的研究給予更多關注。

六、結語與展望

在回顧的諸多文獻中，我們發現強大的光譜技術似乎只在澱粉樣蛋白的分析上扮演者次要的角色，以致於未能通過闡明寡聚體結構的新細節來推進我們對澱粉樣蛋白的各種聚集途徑的基本理解。我們希望在本文提到的這些傑出技術，可以更頻繁地用於觀察單個分子的自然狀態，即使存在無法解釋所有觀察結果的風險。

導致不同澱粉樣蛋白聚集途徑的機制至今仍然知之甚少。這主要是由於非纖維低聚物是一組具有高度多樣性，且通常缺乏長期穩定性，以致於無法在大型綜集中進行詳細研究。然而，這種多樣性本身也為研究由相同基本構建塊組裝而成的各種構形提供了一個迷人的機會，並以這種方式開啟了我們對各種醫學狀況的理解。進行單個或低拷貝數分子研究的關鍵思想是避免由整體綜集平均方式所引起的錯誤和訊息遺漏。

單分子技術最好在相對低信噪比的情況下加以利用。分子構形變化和布朗運動可能會影響短時間尺度上光譜特徵的位置和寬度。這意味著通過在短曝光時間內評估足夠多的統計數據，亦可以揭示比平均光譜更多樣化的訊息，例如使用其他成熟的低拷貝數分析技術，例如動態光散射或熒光相干光譜學。

七、致謝

本文材料主要根據於新近發表的評論文章[71]。我們感謝中研院（深耕計畫AS-IA-109-M04）、國科會（110-2124-M-001-003）、及美國空軍科研辦公室（FA9550-21-1-0430 and FA2386-21-1-4070）於研究經費的大力支助。

參考資料：

  1. Chiti, F. and C.M. Dobson, Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annu Rev Biochem, 2017.86: p. 27-68.
  2. Sengupta, U., A.N. Nilson, and R. Kayed, The Role of Amyloid-beta Oligomers in Toxicity, Propagation, and Immunotherapy. EBioMedicine, 2016. 6: p. 42-49.
  3. Bucciantini, M., et al., Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature, 2002. 416（6880）: p. 507-11.
  4. Kayed, R., et al., Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science, 2003. 300（5618）: p. 486-9.
  5. Alies, B., C. Hureau, and P. Faller, The role of metal ions in amyloid formation: general principles from model peptides. Metallomics, 2013. 5（3）: p. 183-92.
  6. Viles, J.H., Metal ions and amyloid fiber formation in neurodegenerative diseases.Copper, zinc and iron in Alzheimer's, Parkinson's and prion diseases. Coord. Chem. Rev., 2012. 256（19-20）: p. 2271-2284.
  7. Chen, W.T., et al., Distinct effects of Zn2+, Cu2+, Fe3+, and Al3+ on amyloid-beta stability, oligomerization, and aggregation: amyloid-beta destabilization promotes annular protofibril formation. J Biol Chem, 2011. 286（11）: p. 9646-56.
  8. Deas, E., et al., Alpha-Synuclein Oligomers Interact with Metal Ions to Induce Oxidative Stress and Neuronal Death in Parkinson's Disease. Antioxid Redox Signal, 2016. 24（7）: p. 376-91.
  9. Lee, M.C., et al., Zinc ion rapidly induces toxic, off-pathway amyloid-beta oligomers distinct from amyloid-beta derived diffusible ligands in Alzheimer's disease. Sci Rep, 2018. 8（1）: p. 4772.
  10. Rezaei-Ghaleh, N., et al., Effect of zinc binding on beta-amyloid structure and dynamics: implications for Abeta aggregation. Biophys J, 2011. 101（5）: p. 1202-11.
  11. Larkin, P., Infrared and Raman Spectroscopy; Principles and Spectral Interpretation. 2011, Amsterdam, The Netherlands: Elsevier.
  12. Fleming, K.G., Fluorescence Theory, in Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry（Third Edition）, J.C. Lindon, G.E. Tranter, and D.W. Koppenaal, Editors. 2017, Academic Press: Oxford, UK. p. 647-653.
  13. Biter, A.B., et al., A method to probe protein structure from UV absorbance spectra. Anal Biochem, 2019. 587: p. 113450.
  14. Kelly, S.M. and N.C. Price, Circular dichroism to study protein interactions. Curr Protoc Protein Sci, 2006. 46: p. 20.10.1-20.10.18.
  15. Calero, M. and M. Gasset, Fourier Transform Infrared and Circular Dichroism Spectroscopies for Amyloid Studies, in Amyloid Proteins: Methods and Protocols,E.M. Sigurdsson, Editor. 2005, Humana Press: Totowa, NJ. p. 129-151.
  16. Ding, S.-Y., et al., Nanostructure-based plasmon-enhanced Raman spectroscopy for surface analysis of materials. Nat. Rev. Mater., 2016. 1（6）: p. 16021.
  17. Kneipp, K., et al., Surface-enhanced Raman scattering and biophysics. Journal of Physics: Condensed Matter, 2002. 14（18）: p. R597.
  18. Langer, J., et al., Present and Future of Surface-Enhanced Raman Scattering. ACS Nano, 2019. 14（1）: p. 28–117.
  19. Schuler, B., Perspective: Chain dynamics of unfolded and intrinsically disordered proteins from nanosecond fluorescence correlation spectroscopy combined with single-molecule FRET. J Chem Phys, 2018. 149（1）: p. 010901.
  20. Ferreon, A.C.M., et al., Single-Molecule Fluorescence Studies of Intrinsically Disordered Proteins, in Single Molecule Tools: Fluorescence Based Approaches, Part A. 2010, Academic Press: Cambridge, MA, USA. p. 179-204.
  21. Wagele, J., et al., How Fluorescent Tags Modify Oligomer Size Distributions of the Alzheimer Peptide. Biophys J, 2019. 116（2）: p. 227-238.
  22. Eftink, M.R., The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. Biophys J, 1994. 66（2 Pt 1）: p. 482-501.
  23. Greenfield, N.J., Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nat Protoc, 2006. 1（6）: p. 2876-90.
  24. Khrapunov, S., Circular dichroism spectroscopy has intrinsic limitations for protein secondary structure analysis. Anal Biochem, 2009. 389（2）: p. 174-6.
  25. Karamanos, T.K., et al., Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc, 2015. 88-89: p. 86-104.
  26. Puthenveetil, R. and O. Vinogradova, Solution NMR: A powerful tool for structural and functional studies of membrane proteins in reconstituted environments. J Biol Chem, 2019. 294（44）: p. 15914-15931.
  27. Pelton, J.T. and L.R. McLean, Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure. Anal Biochem, 2000. 277（2）: p. 167-76.
  28. Barth, A., Infrared spectroscopy of proteins. Biochim Biophys Acta, 2007. 1767（9）: p.1073-101.
  29. Siddhanta, S. and C. Narayana, Surface Enhanced Raman Spectroscopy of Proteins: Implications for Drug Designing. Nanomaterials and Nanotechnology 2012. 2: p. 1.
  30. Rygula, A., et al., Raman spectroscopy of proteins: a review. Journal of Raman Spectroscopy.2013. 44（8）: p. 1061-1076.
  31. Milosevic, J., R. Prodanovic, and N. Polovic, On the Protein Fibrillation Pathway: Oligomer Intermediates Detection Using ATR-FTIR Spectroscopy. Molecules, 2021. 26（4）: p. 970.
  32. Nabers, A., et al., An infrared sensor analysing label-free the secondary structure of the Abeta peptide in presence of complex fluids. J Biophotonics, 2016. 9（3）: p. 224-34.
  33. Nabers, A., et al., Amyloid-beta-Secondary Structure Distribution in Cerebrospinal Fluid and Blood Measured by an Immuno-Infrared-Sensor: A Biomarker Candidate for Alzheimer's Disease. Anal Chem, 2016. 88（5）: p. 2755-62.
  34. Nabers, A., et al., Amyloid blood biomarker detects Alzheimer's disease. EMBO Mol Med, 2018. 10（5）: p. e8763.
  35. Lomont, J.P., et al., Spectroscopic Signature for Stable beta-Amyloid Fibrils versus beta-Sheet-Rich Oligomers. J Phys Chem B, 2018. 122（1）: p. 144-153.
  36. Zhuang, W., et al., Discriminating early stage A{beta}42 monomer structures using chirality-induced 2DIR spectroscopy in a simulation study. Proc Natl Acad Sci USA, 2010. 107（36）: p. 15687-92.
  37. Dicke, S.S., et al., Metastable intermediate during hIAPP aggregation catalyzed by membranes as detected with 2D IR spectroscopy. RSC Chem Biol, 2022. 3（7）: p.931-940.
  38. Qi, Q., et al., Fabrication, Characterization, and Application of Large-Scale Uniformly Hybrid Nanoparticle-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates. Micromachines （Basel）, 2019. 10（5）: p. 282.
  39. D'Urso, L., et al., Detection and characterization at nM concentration of oligomers formed by hIAPP, Abeta（1-40） and their equimolar mixture using SERS and MD simulations. Phys Chem Chem Phys, 2018. 20（31）: p. 20588-20596.
  40. Bhowmik, D., et al., Cell-Membrane-Mimicking Lipid-Coated Nanoparticles Confer Raman Enhancement to Membrane Proteins and Reveal Membrane-Attached Amyloid-beta Conformation. ACS Nano, 2015. 9（9）: p. 9070-7.
  41. Banchelli, M., et al., Nanoscopic insights into the surface conformation of neurotoxic amyloid beta oligomers. RSC Adv, 2020. 10（37）: p. 21907-21913.
  42. Hoffmann, W., et al., NFGAIL Amyloid Oligomers: The Onset of Beta-Sheet Formation and the Mechanism for Fibril Formation. J Am Chem Soc, 2018. 140（1）: p. 244-249.
  43. Ruggeri, F.S., et al., Microfluidic deposition for resolving single-molecule protein architecture and heterogeneity. Nat Commun, 2018. 9（1）: p. 3890.
  44. Ruggeri, F.S., et al., Atomic force microscopy for single molecule characterisation of protein aggregation. Arch Biochem Biophys, 2019. 664: p. 134-148.
  45. Ruggeri, F.S., et al., Infrared nanospectroscopy reveals the molecular interaction fingerprint of an aggregation inhibitor with single Abeta42 oligomers. Nat Commun, 2021. 12（1）: p. 688.
  46. Feuillie, C., et al., High Speed AFM and NanoInfrared Spectroscopy Investigation of Abeta1-42 Peptide Variants and Their Interaction With POPC/SM/Chol/GM1 Model Membranes. Front Mol Biosci, 2020. 7: p. 571696.
  47. Dou, T., L. Zhou, and D. Kurouski, Unravelling the Structural Organization of Individual alpha-Synuclein Oligomers Grown in the Presence of Phospholipids. J Phys Chem Lett, 2021. 12（18）: p. 4407-4414.
  48. Nie, S. and S.R. Emory, Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering. Science, 1997. 275（5303）: p. 1102-6.
  49. Kneipp, K., et al., Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering （SERS）. Phys. Rev. Lett., 1997. 78（9）: p. 1667-1670.
  50. Lesser-Rojas, L., et al., Low-Copy Number Protein Detection by Electrode Nanogap-Enabled Dielectrophoretic Trapping for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and Electronic Measurements. Nano Letters, 2014. 14（5）: p. 2242-2250.
  51. Blum, C., et al., Tip-enhanced Raman spectroscopy - an interlaboratory reproducibility and comparison study. J Raman Spectrosc, 2014. 45（1）: p. 22-31.
  52. Wang, X., et al., Fundamental understanding and applications of plasmon-enhanced Raman spectroscopy. Nat. Rev. Phys, 2020. 2（5）: p. 253-271.
  53. Khater, I.M., I.R. Nabi, and G. Hamarneh, A Review of Super-Resolution Single-Molecule Localization Microscopy Cluster Analysis and Quantification Methods. Patterns （NY）, 2020. 1（3）: p. 100038.
  54. Kurouski, D., et al., Surface characterization of insulin protofilaments and fibril polymorphs using tip-enhanced Raman spectroscopy （TERS）. Biophys J, 2014. 106（1）: p. 263-71.
  55. vandenAkker, C.C., et al., Nanoscale Heterogeneity of the Molecular Structure of Individual hIAPP Amyloid Fibrils Revealed with Tip-Enhanced Raman Spectroscopy. Small, 2015. 11（33）: p. 4131-9.
  56. Darussalam, E.Y., et al., pH-dependent disintegration of insulin amyloid fibrils monitored with atomic force microscopy and surface-enhanced Raman spectroscopy. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2021. 256: p. 119672.
  57. Louros, N.N., et al., Tracking the amyloidogenic core of IAPP amyloid fibrils: Insights from micro-Raman spectroscopy. J Struct Biol, 2017. 199（2）: p. 140-152.
  58. Flynn, J.D. and J.C. Lee, Raman fingerprints of amyloid structures. Chem Commun（Camb）, 2018. 54（51）: p. 6983-6986.
  59. Flynn, J.D., et al., Structural features of alpha-synuclein amyloid fibrils revealed by Raman spectroscopy. J Biol Chem, 2018. 293（3）: p. 767-776.
  60. Zikic, B., et al., Tip-enhanced Raman spectroscopy of Aβ（1-42） fibrils. Chem. Phys. Lett., 2021. 768: p. 138400.
  61. Deckert-Gaudig, T., et al., Spatially resolved spectroscopic differentiation of hydrophilic and hydrophobic domains on individual insulin amyloid fibrils. Sci Rep, 2016. 6: p. 33575.
  62. Bonhommeau, S., et al., Tip-Enhanced Raman Spectroscopy to Distinguish Toxic Oligomers from Abeta1-42 Fibrils at the Nanometer Scale. Angew Chem Int Ed Engl, 2017. 56（7）: p. 1771-1774.
  63. Devitt, G., et al., Conformational Evolution of Molecular Signatures during Amyloidogenic Protein Aggregation. ACS Chem Neurosci, 2019. 10（11）: p. 4593-4611.
  64. D'Andrea, C., et al., Nanoscale Discrimination between Toxic and Nontoxic Protein Misfolded Oligomers with Tip-Enhanced Raman Spectroscopy. Small, 2018. 14（36）: p. e1800890.
  65. Vu, K.H.P., et al., Time-Evolved SERS Signatures of DEP-Trapped Abeta and Zn（2+）Abeta Peptides Revealed by a Sub-10 nm Electrode Nanogap. Anal Chem, 2021. 93（49）: p. 16320-16329.
  66. Holzel, R., et al., Trapping single molecules by dielectrophoresis. Phys Rev Lett, 2005. 95（12）: p. 128102
  67. Ruggeri, F.S., et al., Single molecule secondary structure determination of proteins through infrared absorption nanospectroscopy. Nat Commun, 2020. 11（1）: p. 2945.
  68. Clement, J.E., et al., Spectral pointillism of enhanced Raman scattering for accessing structural and conformational information on single protein. Phys Chem Chem Phys, 2016. 19（1）: p. 458-466.
  69. Leray, A., et al., Conformational Changes and Charge Transfer in Biomolecules Resolved Using Dynamic Enhanced Raman Correlation Spectroscopy. J Phys Chem B, 2019. 123（9）: p. 1931-1938.
  70. Huang, J.A., et al., Multiplexed Discrimination of Single Amino Acid Residues in Polypeptides in a Single SERS Hot Spot. Angew Chem Int Ed Engl, 2020. 59（28）: p.11423-11431.
  71. Vu, K.H.P., et al., Applications of Single-Molecule Vibrational Spectroscopic Techniques for the Structural Investigation of Amyloid Oligomers. Molecules, 2022. 27（19）: p. 6448.