螢光顯微鏡在蛋白質本身的尺度觀察它們

有些時候，看似基本的物理極限並不是這麼不可踰越，一個例子便是繞射極限：光不能聚焦到比它波長一半還小的點，因此要利用可見光來成像小於200nm的特徵似乎是不可能的。不過，研究人員突破繞射極限並贏了，正如2014年諾貝爾化學獎所強調的（參閱Physics Today，2014 年12 月號第18頁），三位得主：Eric Betzig、Stefan Hell 與William Moerner，以及其他人發展出巧妙的方法，利用可見螢光顯微鏡得到約20 nm 解析度的影像，而這解析度的革命才正要開始。

20nm的解析度可以看見許多東西，在生物系統裡—最吸引人的成像目標，因為它們未知的奈米級複雜性—這是胞器（organelles）、蛋白質複合體及其它許多超分子結構（supramolecular structures）的尺度（例如，參閱Physics Today，2015年5月號第14頁），不過有很多依然看不見。許多重要的特徵（包括個別蛋白質的形狀與構型）小了一個數量級，而且靜止影像徹底遺漏可以說是生命系統內最重要的事情：它們隨時間變化的方式。

諾貝爾獎後的幾年，超解析度研究人員一直推動提升空間與時間兩者的解析度，他們現在達到了同時達成奈米及毫秒精確度的地步—好到能夠即時觀看蛋白質的運動—如德國海德堡兩個研究團隊的新工作所展示，其中一個是由歐洲分子生物實驗室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL）的Jonas Ries 所領導[1]，另一個是Max Planck 醫學研究所（Max Planck Institute for Medical Research）的Stefan Hell 帶領[2]。兩個團隊皆使用Hell 與同事在2017 公開的技術MINFLUX，並都是研究馬達蛋白質驅動蛋白（motor protein kinesin，繪於圖一中），其功能是在細胞內將貨物從一個地方帶到另一個地方。

細緻的精確度是個妥協：研究人員並不是得到驅動蛋白及它所有周遭的完整移動影像，而是僅追蹤一個稱為螢光團（fluorophore）的螢光分子之位置，但透過螢光團在驅動蛋白上附著位置的明智選擇，他們可深入了解分子如何移動，並可能對其它在相同時間尺度運作的蛋白質有類似的理解。

為什麼如此慢？
其中一個讓超解析成像成為可能的關鍵見解是，儘管一堆密集的螢光團整體模糊，但在周圍沒有其它光源的情況下，單獨孤立的螢光團位置是可以被精確定位的。要做此事有許多方法，最簡單的只要用相機拍照，螢光團看起來是繞射極限的斑點，寬幾百奈米，但斑點的中心（因此，想必是螢光團的位置）可以用更高的精度來測定。

單螢光團定位（single-fluorophore localization）比贏得諾貝爾獎的超解析工作早了數十年（實際上是驅動蛋白機制早期研究的基礎，在下面會提到），諾貝爾獎表彰了一套從大量單螢光團的偵測以得到複雜結構完整影像的技術發展，但不意外地，這個成像要花很長的時間，大約數分鐘，太過於緩慢無法研究任何類型的生物動力學。

圖一：驅動蛋白（Kinesin，在藝術家繪圖中以橘色表示）是一個在細胞內部攜帶貨物（透明球體）的馬達蛋白。驅動蛋白沿著微管（細胞骨架的一部分，以綠色與紅色顯示）交替移動它的腳行走，一隻腳在另一隻腳前面。但截至現在，它的動作太快而無法直接被詳細研究。（影像提供：Kateryna Kon/Shutterstock.com）

但從繞射極限斑點即使只是去定位一個螢光團，都仍是不切實際的慢，而且在實踐上它的空間精度遠低於理論上的理想值。為了能以奈米精度來精準定位光斑的中心，我們需要非常清楚它的形狀，這需要收集上千顆的光子。所有這些光子都來自相同螢光團的螢光發射，這必須在相同的兩個量子態之間循環數千次。不過，並不是所有螢光團都能承受這麼多次的循環—它們早在發射足夠光子之前就被雷射傷害或掉進非螢光放射的量子態—而對於那些可承受的，這過程需要數十到數百毫秒。定位可在螢光團上更快速、更溫和地進行，但代價是空間解析度。

此外，不論偵測到多少光子，相機定位有一個系統性的極限。螢光團以偶極的形式吸收與放射光，因此它們的螢光不會在所有方向平等放射，假如螢光團沒有在曝光時間內自由地旋轉，相機上螢光斑點的中心可能會跟螢光團的真實位置相差數奈米，因此限制了影像解析度。

其它的技術能夠以高空間精確度來研究生物分子， 如冷凍電子顯微鏡（cryoelectron microscopy， 該技術亦獲得諾貝爾獎， 請參閱Physics Today，2017年12月號第22頁）與它的表親冷凍電子斷層掃描（cryoelectron tomography），但它們需要冷凍的樣本。將分子拴在光學阱內的珠子上，可追蹤奈米與微秒尺度的分子運動（參閱Physics Today，2016年6月號第14頁），但這不保證「繫繩」所施加的力不會干擾分子的自然運動。螢光成像吸引人之處是它們相對良性而無侵入性，因此能與活細胞相容，但它還沒達到研究運動中胞器（cellular machinery）的潛力。

在黑暗中
Hell 對於MINFLUX 的想法不是用螢光團放出的光子而是用” 沒放出” 的光子來偵測螢光團。「你仍需要大量的光子才能將分子定位到1個奈米之內」，他說：「這來自測不準原理，你無法避開它。不過我們可以把所需的光子數量重擔放在雷射而不是螢光團上，雷射光子不會短缺。」在原始的MINFLUX（不是英文第一個字母的縮寫，而是最小螢光光子通量”minimal fluorescence photon flux” 的簡寫）中，分子被甜甜圈形輪廓的雷射光束照射[3]，當分子位於甜甜圈的正中心，它不會放出螢光，即使僅有一顆螢光光子都足以顯示分子稍微偏離中心。

要確定它偏離中心的方向有點棘手，不過Hell 與同事發展出一套能快速有效掃描雷射束位置並對準分子的演算法（其版本顯示在圖二a中）：定位精確度與偵測到的螢光光子數目呈指數關係（作為比較，相機定位的解析度和螢光光子數目的平方根成比例）「這是件大事」，他說：「這是它如此有效率的原因。」MINFLUX 可提供以許多螢光團標記的整個樣本的完整（但緩慢）影像，但它也是首度可用來同時以奈米及毫秒精確度追蹤單一螢光團。

MINFLUX儀器是特製的，有一點複雜，最初只有存在於Hell的實驗室，不過Hell很快就透過他的衍生公司Abberior Instrument將這個技術商業化，讓更廣大的社群能使用這技術。第一個商業雛形交給了EMBL，那裡的Ries已經和Hell合作將MINFLUX應用在生物上。Ries表示：「我們在尋找一種應用是除了MINFLUX以外沒有任何技術可能做到的。」「而很快地，我們找到活細胞中的馬達蛋白，特別是驅動蛋白。」

圖二：MINFLUX，一種可見螢光的技術，利用最小的螢光光子通量能快速精確地找到螢光分子的位置（黃色星星）。在它原始且近期商業化的版本（a）中，甜甜圈形狀的光束（綠色）探測一個被認為含有分子的圓之周圍幾個位置，圓的直徑L 被迭代縮小來以奈米精確度尋找分子。在它的新開發版本（b）中，甜甜圈光束以線性干涉圖形（紅色）取代，儘管分子現在必須分別以水平與垂直的方向定位，但這個定位過程更快速且更準確。（a 圖改編自參考文獻1；b圖改編自參考文獻2）

而同時Hell 也在研究驅動蛋白， 不是在活細胞，而是當成他團隊所研發的新版本MINFLUX 的測試系統。如圖二b 顯示，新的MINFLUX 顯微鏡以線性干涉圖形取代了甜甜圈光束，用它的左右偏移來定位水平方向上的螢光團，這個程序需要重複，再利用垂直的干涉圖形來尋找分子的垂直位置。由於強度分布比甜甜圈光束更適於快速精確定位，這提高了空間與時間的解析度，以及對驅動蛋白如何運動前所未有的觀察。

像驅動蛋白一樣走路

從圖一的圖解中，很難不看出驅動蛋白與火柴人(stick figure)的相似之處，這分子有兩隻腳沿著一條微管（細胞骨架的一部分）走路，以及兩隻手抓著貨物在細胞周圍搬運它。不過，形式上的相似並不一定代表驅動蛋白像人類一般運動。有很長一段時間，研究人員爭論著驅動蛋白是否真的在走路—兩腳交替的腳步，每一隻腳放在另一隻腳前面—或它是否像毛毛蟲一樣曳足而行，總是同一隻腳在前面。

這個問題最早在2004 年由伊利諾大學香檳分校的Paul Selvin 與同事解答，他們利用一種稱為FIONA（FIONA 代表著”fluorescence imaging with one-nanometer accuracy”，儘管它沒有產生完整的影像，而且實際上解析度大於1 nm）的技術，研究團隊將一個強健的螢光團附著在驅動蛋白的一隻腳上，並收集必要的數千顆光子來定它的位置。從其它的方法已經知道驅動蛋白本體在每一步移動8 nm，Selvin 與同事發現腳一次移動16nm，這是行走中腳交替移動的明顯標誌[4]。

為了得到這個結果，他們必須讓驅動蛋白缺乏燃料來減緩它的速度，驅動蛋白在全速走路時每秒走10 步，而一次FIONA 定位要花0.33 秒。就像大部分的胞器，驅動蛋白仰賴三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）運作，Selvin 與他同事在他們的體外（in vitro）實驗中，只供應細胞內所發現的ATP 濃度的千分之一，讓驅動蛋白的速度降到小於每秒一步，慢到足夠讓他們能測量其運動。

Ries 與同事現在在活細胞中複製這些測量—不是因為他們預期會發現任何明顯不同的結果，而是因為「一般來說，將體外研究所看到的帶入生理條件並驗證它們是必要的。」Ries 表示：「而且從技術面證明奈米尺度動力學，可在活細胞中研究相當重要，即使有其複雜性與背景，我們希望能夠鼓勵其他研究人員在更天然的條件下研究蛋白質動力學。」圖三a只顯示他們所獲得的其中一條數據軌跡。

圖三：將螢光團（黃色星星）附著在驅動蛋白分子的不同部分來探測分子運動之不同面向。（a）驅動蛋白腳上的螢光團揭示16 nm 的步伐長度。由於驅動蛋白本體在每一步移動8 nm，這個步伐長度便是驅動蛋白交替腳步的明顯指標，這裡所展示的數據是在活細胞中記錄。（b）驅動蛋白莖部（stalk）側邊上的螢光團顯示莖部在每一步旋轉了180°，這個發現解決了（但不是決定性的）驅動蛋白走路是否面向前走路或像芭蕾舞者一樣旋轉的問題。（a 圖改編自參考文獻1；b 圖改編自參考文獻2）

僅僅知道驅動蛋白以交替步伐行走並不能解釋其機制的所有一切。它真的是面朝前走路，右腳在右邊、左腳在左邊嗎？抑或是它像芭蕾舞者的平轉（Chaîné），每一腳在同側經過另一隻腳？ Hell 和同事們希望能透過他們改良過更高解析度的MINFLUX 測量來解答諸如此類的問題。

在旋轉的驅動蛋白中，每一步莖部（stalk）會旋轉180°，其正面變成背面、而背面變成正面。莖部本身太細，即使是MINFLUX 也無法分辨它的正面和背面，但由於螢光團的大小不為0，這個技術能區分附著於莖正面與背面的螢光團。如圖3b 所示，旋轉的驅動蛋白莖部上的螢光團會看起來是6 nm 與10 nm 的交替步伐，儘管莖部本身每一次穩定前進8 nm。當Hell 與同事進行這項實驗時，交替的步伐大小正是他們發現的。這結果並不是旋轉機制的決定性證據（驅動蛋白仍可能在面向前走路的同時，從一側轉到另一側），不排除這樣的可能性。

下一步
兩個團隊的MINFLUX 實驗， 都著重於在沒有關於系統其它部分動力學的資訊下，追蹤單一螢光團的位置，這種能力適用於研究驅動蛋白，因為微管在實驗的時間尺度並沒有移動太多，即使是在活細胞內；但更強大的工具是能同時追蹤發出不同顏色螢光的兩個螢光團的位置，雙顏色實驗可監測蛋白質的交互作用或是構型，在驅動蛋白每隻腳上各放一個螢光團，就能解決驅動蛋白是走路還是旋轉的問題，Ries 表示：「這正是我們在努力設計的下一步。」

對Hell 來說， 下一個MINFLUX 前沿是進一步推動這個技術的解析度。空間解析度已經是最好的了，因為它受限於螢光團的大小，但時間精度還有改進的空間。Hell 表示：「限制的因素為螢光團亮度。」更有效率發出螢光的分子能以更少的時間提供許多相同的位置資訊，「利用更亮的螢光團，我們可從每毫秒1奈米降到每10 微秒1 奈米。」他說：「這沒有理由不可能。」

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參考資料：
[1] T. Deguchi et al, Science 379, 1010（2023）.
[2] J. O. Wolff et al, Science 379, 1004（2023）.
[3] F. Balzarotti et al, Science 355, 606（2017）.
[4] A. Yildiz et al, Science 303, 676（2004）.
[5] A. G. Smart, Physics Today 67（12）, 18（2014）.
[6] J. L. Miller, Physics Today 68（5）, 14（2015）.
[7] J. L. Miller, Physics Today 70（12）, 22（2017）.
[8] J. L. Miller, Physics Today 69（6）, 14（2016）.

本文感謝Physics Today（American Institute of Physics）同意物理雙月刊進行中文翻譯並授權刊登。原文刊登並收
錄於Physics Today, May. 2023 雜誌內（Physics Today 76, 5, 14（2023）; https://doi.org/10.1063/PT.3.5230）。原文作者：
Johanna L. Miller。中文編譯：張鳳吟，國立陽明交通大學物理學系博士。
Physics Bimonthly（The Physics Society of Taiwan）appreciates Physics Today（American Institute of Physics）
authorizing Physics Bimonthly to translate and reprint in Mandarin. The article is contributed by Johanna L. Miller and was
published in（Physics Today 76, 5, 14（2023）; https://doi.org/10.1063/PT.3.5230）. The article in Mandarin is translated
and edited by F. Y, Chang, National Yang Ming Chiao Tung University.