當發生疫情時， 基礎研究能幫上什麼忙？

以生物感測研究用於病毒篩檢及抗病毒感染藥物篩選為例

一、楔子

2020 年一月中旬，筆者在東京的秋葉原免稅店內帶著孩子閒晃時，突然一個店員以中文向我推銷隨身型的空氣濾清器，並神祕地說道，近幾天大陸內地的觀光客買了好些個隨身型的空氣濾清器，因為他們那發生了一種比流感還嚴重的不明原因肺炎，（後來被世衛組織命名為新冠肺炎，COVID-19[1]）。本人一向對購物不感興趣，又不敏於時勢，一時想到大陸那麼大，發生流感應該還好，也沒放在心上。沒想到隨著交通便利，國界圍籬逐漸淡化的年代，各種疾病蔓延擴散，已不再是地區性的個案。稍不注意，高傳染性，高致死率可能隨著交通的便利，在國際間快速地爆發開來。新冠肺炎（COVID-19）依聯合國世界衛生組織2023 年二月21 日統計指出，自2019 年十二月起到2023 年的現在，累計造成全球近七億六千萬人受感染，逾六百八十五萬人死亡[2]。台灣迄今也有逾千萬人（有紀錄的）受到新型冠狀病毒（SARSCoV-2）感染。在疫情爆發尖峰期間許多國家的醫療能量幾乎崩潰，社會經濟損失更是巨大，堪稱世紀災難。在這世紀災難之中，我們科學家能在這場災難中做些什麼？

隨著疫情爆發不同的時程中，學界業界對造成疫情的新型病毒實際的應對方案不外有包含病毒的偵測，疫苗的製造，預防病毒感染藥物篩選與治療藥物篩選等四方面。

在過去三年內，我們可以看到病毒的偵測方面，造就了核酸分析產業如流星雨一般橫空出世，俗話說“ 三折肱為良醫”，現在世界各地街頭巷尾大多數人都知道什麼是核酸定量分析[3]，同時各種快篩也成了大家熟悉的產品。疫苗的製造的事情更是將多年研究的基礎馬上搬上檯面，有句老話說“ 事急馬行田，老鼠晾一邊”。原來按部就班的疫苗發展順序，一下子等不及了，世界各國的政要一個個捐出手臂，挨上幾針以安民心。治療藥物的篩選更是迅速，原來用來抗SARS、抗病毒甚至是抗癌症的既有藥物，全都用上了。這些作為，都在在考驗國家在平時的基礎研究能量儲備，期望能在極短時間內，應對多變的疫情局勢，對人類做出最佳的應對，促進人類的健康與安全，達到『承平儲備，戰時發揮』的功效。

筆者的研究團隊專長在於基因重組蛋白質生合成、蛋白質摺疊、新功能生物分子開發、生物分子自組裝、與生物感測等研究。對於新冠病毒的肆虐，筆者的研究團隊則可著墨於新冠病毒檢測與抗病毒感染藥物的篩選之生物感測器開發，以期能對新冠病毒疫情抑制有所貢獻。本文將就生物感測研究中，各種相關的研究與應用，藉此文與大家進行交流與分享。

二、新冠病毒檢測平台的開發

1. 新冠病毒結合蛋白的篩選
當人們面臨一種新型可造成人類疾病，進而對全體社會造成嚴重影響的病毒，要如何快速且正確的偵測變成一個具時效性且重大的研發議題。傳統的方式是利用抗原抗體辨識法進行檢測。病毒或其他不同的病原微生物一般上是通過其表面分子與配對宿主細胞進行對接（Attachment）來達成感染宿主的第一步。表面分子的成份可為蛋白質，脂質，醣類物質。這其中以蛋白質為最大宗，病原表面蛋白質與宿主表面的受體分子（receptor）形成專一性連結， 而後利用細胞的胞飲（endocytosis）進入細胞。如何利用快速篩選適當的結合胜肽或小分子量蛋白質？其實可以回溯到1970 年代利用免疫學的方式，病原體或者是部分分子（常見為蛋白質）利用免疫動物產生對病原體專一性抗體，由此得到針對病源的結合蛋白質，然此一方法，雖然抗體針對病源分子結合力強（一般來說解離常數（disassociation constant；Kd ~ nM）都在奈摩爾濃度等級），但篩選作業耗時長，平均為三到六個月，非常難以應付現在疫情瞬息萬變。而且如何取得合適的新冠病毒抗原，在2020年初的台灣除了少數被授權的實驗室外，其他的研究單位基本上是不可能的，更不可能取得這類抗原所產生的抗體。此外目前世界研究的趨勢在於儘量避免動物實驗，能避免用動物取抗體就避免。

所幸只要以基因重組方式，當我們知道了相關基因序列，就可以將此病毒之合適抗原區域以大腸桿菌生合成的方式產生。問題在新型病毒序列，如何取得？病毒的哪個部分，合適作為抗原呢？還好在2020 年二月11 日Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses 即將新冠病毒（SARS CoV-2）基因組序列發布於bioRxiv，接著並於三月刊登於Nature Microbiology上[4]。接著在2020 年四月初上海同濟大學醫學院左為教授團隊[5] 及美國明尼蘇達大學獸醫與醫學科學系Fang Li 研究團隊[6] 分別發表學術論文指出，新冠病毒是藉由新冠病毒的棘蛋白（Spike protein）與人類細胞表面第二型血管收縮素轉化酶（hACE2）接合進而進入人類細胞。當我們知道了SARS CoV-2的基因序列，又有了受體基因與結構，這時棘蛋白與人類細胞表面第二型血管收縮素轉化酶的生和成就不是問題了。是不是我們可能都不用打老鼠產抗體了，直接用棘蛋白與hACE2 來檢測新冠病毒就好了嗎？容我們繼續深入探討。

但是如果要找出hACE2 以外的棘蛋白接合蛋白我們又有哪些方法呢？以下介紹一些如何利用快速的方法，篩選對病毒，與各種病原接合的小胜肽或小蛋白質分子間的交互作用的方法。
隨著1980~1990 年代分子生物學發展，許多基於蛋白分子間的交互作用來達成篩選目的平台因此被發明。筆者將各種方法，一一介紹如下：

a. 酵母菌雙雜合系統（yeast two hybrid system）

首先以目標蛋白質當作餌（bait）是利用基因操作的方式與酵母菌gal4 蛋白質與啟動子結合部位（binding domain）形成一複合蛋白。而候選蛋白質群則與gal4 基因的轉錄活化部位（activation domain）結合，利用兩個匹配複合蛋白質因相互結合促使下游基因的啟動，從而在候選蛋白質群中篩选出能與目標蛋白質互相連接的蛋白質。

酵母菌雜合系統最經典的例子，就屬抑癌蛋白質P53，利用酵母菌雜合的方式找出與之結合HDM2 蛋白質[7]。而HDM2 是一種鋅手指核磷蛋白，是P53 通路的負調節因子，通常在癌細胞中過表達，並且與癌細胞增殖和存活有關。

也了解到由於P53 與HDM2 結合，使得P53 蛋白質失去抑制癌細胞生長得特性。但也因為兩者蛋白質結合，篩檢出P53/HDM2 口服藥CGM097 相互作用抑製劑，抑制HDM2 蛋白與腫瘤抑制蛋白P53 的轉錄活化域的結合。使得P53 恢復抑癌特性，造成癌細胞的凋亡（apoptosis）[8]。以下圖一就是酵母箘雜合篩選結合蛋白質得原理，一般與轉錄調控相關基因表現的蛋白質，均會選擇此方法。

圖一：酵母菌雙雜合系統（yeast two hybrid system）示意圖。

b. 遠西方點墨法（Far-western blotting）

西方點墨法是利用全細胞或全組織蛋白質以電泳分離後，再以電性轉漬於轉漬膜上，以待測目標蛋白質抗體辨認，轉漬膜上已變性的目標蛋白質，接著利用二級抗體作為呈色或發光的標記，用已確認該細胞或組織內是否有該目標蛋白質表現。而遠西方點墨法與西方點墨法的差異在於，將全細胞或全組織蛋白質以電泳分離後，再以電性轉漬於轉漬膜後多進行一步原位復性的程序，使得轉漬膜上原先已變性的全細胞或全組織蛋白質回復其部分或全部功能，接著以標的蛋白質作用，形成分子間交互作用。其後再以目標蛋白質抗體辨認，呈色，以檢測可以在體外（in vitro）的方式進行檢測蛋白質/ 蛋白質相互作用。最有名的例子是美國生物化學家Roger D. Kornberg，利用遠西方點墨法，將有關與RNA polymerase II（轉錄RNA 聚合酶II）相關參與的蛋白質，藉以闡明了有關DNA 轉錄RNA 過程中各參與蛋白質的功能與順序，Roger D.Kornberg 獲得了2006 年諾貝爾化學獎桂冠[7,9]（圖二）。

圖二：遠西方點墨法（Far-western blotting）示意圖

c. 噬菌體表現法篩選（Phage display screening）

利用隨機小片段胜肽基因或者是抗體基因連結於細菌病毒（噬菌體）基因體內，藉由細菌將插入基因表現成蛋白質於噬菌體上，形成具有不同蛋白質表現的噬菌體庫，利用此噬菌體庫可與病源分子重複進行接合測試。再加上噬菌體繁殖速度快（101pfu/ml~109pfu/ml 只要3~4 小時）重複與目標蛋白質結合試驗只需7~8 小時。因此便利性，常用來作為快速篩選病源結合蛋白的工具。此一技術的發明，也改變現今抗原變異，也能迅速改變抗原與抗原配對的速度。號稱在試管中也能生基因得變異，此方法的發明人George P. Smith，Sir Gregory P. Winter 利用噬菌體展示並不需經由免疫動物，直接就能形成小胜肽抗體。也因此獲得2018 年諾貝爾化學獎[10]。

圖三：噬菌體表現法篩選（Phage display screening）示意圖

筆者團隊也運用此一方法，篩選新冠病毒的棘蛋白（SARS-CoV-2 Spike protein）的結合蛋白[11] 如圖三所示。好玩的是我們所篩選出來的胜肽片段中就有hACE2 的片段。因此hACE2 極具檢測新冠病毒的潛力。因此我們研究團隊就著手於基因重組棘蛋白與ACE2 接合功能區之多胜鏈及ACE2 蛋白質之表現，供後續生物感測器之用。而這個生物感測器用的是天然病毒入侵人類路徑之生物分子對，亦可用於後續模擬篩選影響病毒入侵藥物之篩選。

2. 病毒感測平台的開發
生物感測器，除了利用DNA/RNA 合成方式外[3]，多為偵測分子間接合反應所產生之光[12]，振動頻率[13] 或阻抗[14,15] 等變化為標的感測器。我們的研究團隊在電化學感測方面，已有十餘年之經驗，為能及時發揮所長，開發出新冠病毒感測平台，在此利用我們採用電化學平台為開發標的。以電化學方式偵測新冠病毒或腸病毒結合後阻抗改變進行偵測。

電化學感測器主要分工作電極，參考電極與相對電極，而主要是量測工作電極上分子間接合反應前後之電阻抗變化。因此會將待反應物（在此為ACE 2 蛋白質）接合在工作電極上。在15 年前我們以市售之金電極為工作電極，光是電極活化，與蛋白質接合就要耗費一天，而且需使用分子接合劑（crosslinker）。在業界合作夥伴的協助下，我們開發出即用型的奈米鈀薄膜電極（palladium-nanothin-fin electrode）。蛋白質的固定結合，已不需分子接合劑其接合時間也大幅縮短。以下部分將介紹鈀金屬薄膜電極的製程與生物分子偵測原理。

a. 鈀金屬箔膜電極的製程，與偵測病原微生物的工作原理

在鈀金屬箔膜電極的製程中，是採取鈀金屬靶材利用電漿濺鍍於聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）基板，鈀薄膜的厚度平均為20~30 nm，是一種類似Stranski-Krastanov形式的薄膜的電極（圖四）。表面具有鈀金屬（1,1,1）晶相等奈米結構。這種表面奈米結構，有較多類似懸垂鍵活性電子結構，因此可快速地與生物分子表面形成化學鍵合結。以5’硫化DNA 探針為例，DNA 可以20 分鐘的時間內快速固定，形成鈀硫鍵結[14]。此外，針對蛋白質分子，鈀金屬箔膜也同樣具結合力，只需10~20 分鐘即可[15]。

圖四：（A）鈀金屬薄膜電極卷對卷濺鍍機械圖。（B）製成後之鈀金屬薄膜電極，AFM 薄膜表面掃描。（C）薄膜厚度為30 奈米，表面電阻為40 歐姆，並以PET（polyethylene terephthalate）塑膠基材支撐。（D）XRD 掃描鈀金屬薄膜（1,1,1）晶格排列，以利生物分子連接。此為筆者2019 年發表於APL[14]與Inorganic Chemistry Communications[15]，已取Elseviler 授權。

以鈀金屬所製成奈米薄膜電化學電極為基礎，將特定病原體之結合分子固定於鈀奈米薄膜電化學電極，運用病原體與結合分子反應後，以電化學偵測系統偵測其阻抗的改變，進而精準而快速地感知有無感染的風險。例如以本研究團隊所篩選出之腸病毒71 型外殼蛋白鍵結胜肽，當作電化學感測探針，以電化學方式系統性地對腸病毒71型進行偵測試驗，可以於11 分鐘內直接接合腸病毒71 型外殼蛋白鍵結胜肽於電化學電極，並可於1 分鐘內檢測出含有腸病毒71 之1 微升（μL）微量檢體[15]。

b.SARS-Co-V2 檢測平台之開發

如前所述，本團隊以基因重組hACE2 蛋白質為檢測新冠病毒感測探針，但是在2020 年因為台灣防疫成效太佳，病毒管制規範完備，因此需要取得測試病毒極為困難。為此我們先以基因重組新冠病毒棘蛋白為測試標的，我們發現我們所開發的檢測平台上的基因重組hACE2 蛋白質，是可以與基因重組新冠病毒棘蛋白產生交互作用，等效的解離常數在μM 的範圍（圖五）。由於此一感測系統之鍵結強度遠低於以抗體為基礎之感測系統，是否能真的檢測新冠病毒或是新冠偽病毒則是亟待確認的課題。還好我們的合作夥伴長庚大學施信如教授，投入大量人力，物力，於相關生物安全等級之實驗室接續進行，確認我們所開發的新冠病毒檢測平台可與新冠偽病毒作用，並可區分原始野生種或是變異株之作用差異。並可檢驗冷藏不同時間後病毒是否仍可與基因重組hACE2 蛋白質作用。WHO 調查團，藉由我們的檢測平台可模擬體現病毒與人類受體感染作用，因此不排除COVID-19 有可能藉由食物冷鏈而傳播的推測[16]。

圖五：（A）鈀金薄膜電極生物感測平台，以ACE2 修飾於鈀薄膜電極作，並對SARS-CoV-2 的RBD 蛋白的生物感測探針。根據Randal’s model 進行量測。（B）ACE2- 的結合引發的電化學阻抗信號（原始信號）隨RBD 濃度而增大。（C）SARS-CoV-2 偽病毒與ACE2 的阻抗（ΔRct）隨病毒量上升。（D）表示RBD 與ACE2 的結合曲線。此圖為筆者2021 年發表於Biosensors Bioelectronics，並獲Elseviler授權刊登。

三、抗病毒感染藥物篩選平台的開發

一般抗新冠病毒的藥物開發標的，多以抑制病毒增生及平抑病毒感染病患後所引發之免疫風暴為主。相對的若能找到可以干擾新冠病毒感染人體細胞的藥物，將可降低後續病毒感染之機率與重症的比例。我們的研究團隊就是秉持著這個理念，在2020 年二月初就開始積極討論如何開發抗病毒感染藥物篩選平台。如前所述SARS-CoV-2 進入人體，是病毒表面棘蛋白（Spike protein；RBD）與人體細胞表面的血管收縮素轉化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2；ACE2）結合所導致。

於此同時我們的馬大醫學院研究團隊成員ACE2 蛋白質與ACE1 蛋白質序列分析發現，兩者序列十分相似，因此我們推論與ACE1 蛋白質作用之抑制藥物（ACEi）應該有機會與ACE2 蛋白質作用。ACEi 是一系列的藥物，因此我們開始針對美國食品藥物署所許可之藥物庫內之ACEi 進行系統性的模擬分析，篩選出八種ACEi 進行分析。

基於ACE2 蛋白質與ACE1 蛋白質序列相似，本團隊利用此平台探討抗血壓藥物ACEi （ACE1 蛋白質抑製劑）對ACE2 與Spike RBD 結合的影響。結果發現有部分ACEi 有促進ACE2 與RBD 結合（Enalapril，Lisinopril）功效， 有些則有抑制ACE2 與RBD 結合（Perindopril，Ramipril）功效，且這些藥效在真實病毒感染細胞實驗亦可觀察到一致的趨勢[11]，因此可推論ACEi 類藥物因分子結構差别而對ACE2 與RBD 結合存在不同生化調節作用，從而影響病毒感染之機率與重症之可能。此一研究為瑞士ETH的Martin Fussenegger 研究團隊，引為偵測分析分子間交互作用的方法，發表於NatureBiological Chemistry 2022[17]。

四、討論

鈀金屬薄膜偵測，發想於血糖晶片，利用兩分子或多分子結合後，通過微小電流，所產生不同阻抗（Impedance）經由鐵血鹽化學溶液放大阻抗訊號的生物感測。由於鈀薄膜表面具有高化學活性之特性，容易與各種生物分子，如DNA，RNA，蛋白質分子形成化學鍵結。這就克服了生物分子固定化的大問題，再者，所需固定化的分子只需小量體積（1-2 微升），檢測樣品也只需微升的等集即可，這也解決了在檢體取樣的困難。更重要的，是偵測極限濃度為ng/mL 抗原濃度，與傳統快篩試劑動輒需要每毫升1-500微克的抗原濃度，靈敏度相差10 到百倍。因此利用薄膜電極近行快篩，可是大有競爭力。另外在治療藥物的篩檢，以及疫苗接種後中和抗體效價的測試，鈀金屬薄膜電極均占有一席之地。

本文中介紹了如何利用不同方法，快速篩選結合蛋白質；鈀薄膜電極的製程與各種特性。這些看彼此不相關的研究主體，卻在新興感染疾病肆虐的今日，兩者研究相互結合，創造出貢獻。今日世界風雲詭譎，各種不同領域的研究，定能相互結和，創造價值，為人類的福祉謀福。

五、致謝

生物感測平台開發過程最大的困難是經費短絀與樣品取得困難。由於新冠病毒疫情爆發突然，原先規劃研究時並未有相關經費，開發此一平台需要蠻多的研發經費，還好我們的研究團隊成員及業界夥伴共同努力，向科技部、教育部、交大與爭取相關經費，群策群力，才完成此一平台之開發。因此我們需要感謝科技部推動之陽明交通大學防疫中心、臺馬國際半導體與生醫科技創新研究中心、教育部高教深耕計畫項下智慧型藥物與智能生物裝置研究中心之資助。

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