開啟微晶體電子繞射(microcrystal electron diffraction)的潛力

結構生物學家正使用低溫電子顯微鏡來解析奈米晶體中蛋白質的原子級結構。

原子以不同的方式黏在一起而形成分子，構成了我們所接觸和看到的一切。我們的身體是由細胞組成。而細胞是由脂質、蛋白質、核酸、代謝物，以及水組成的。這其中的每一個分子都是由相同的少數原子所組成。但儘管成分相同，分子所擁有的原子數量以及這些原子在空間中的排列方式是不同的。

蛋白質是微小的生物機器。它們在奈米尺度上，透過移動分子、形成或破壞鍵結，以及催化反應來發揮其作用。結構生物學家努力確定在蛋白質中，所有原子的所在位置。要完成這項工作，最常見的方法是使用高能的X射線。將純化的蛋白質培養成三維晶體，在暴露於同調輻射時作為繞射光柵。在X射線的光束中旋轉晶體會產生繞射斑點，便能得知原子在晶體中的位置。

不過，要將蛋白質培養成足夠大的晶體以進行X射線繞射，是具有挑戰性的。事實上，在大部分對人類健康至關重要的蛋白質中，很少是能夠培養成足夠大的晶體來進行X射線繞射的實驗，或者它們對輻射過於敏感，以至於在收集數據前就瓦解了。幸運地是，一種被稱為微晶體電子繞射（microcrystal election diffraction, MicroED）（ref.1）的低溫電子顯微技術（cryogenic electron microscopy, cryo-EM），可以從微小晶體—小至傳統X射線晶體學中所使用晶體大小的十億分之一—中確定蛋白質結構。

該方法使用的低溫電子顯微鏡，與生物學家用來成像大分子複合物或辨別整個細胞的三維結構—分別稱為單粒子成像（single-particle imaging）以及斷層掃描（tomography）技術—所使用的顯微鏡相同。微晶體電子繞射誓言讓結構生物學開啟蛋白質奈米晶體的新境界，並從微小的蛋白質中收集新的詳細資訊。

結構與功能的關係

了解東西的功能是很重要的一件事。例如，這能讓人們知道如何修復損壞的東西。科學家將這種理解稱為結構與功能之間的關係。結構生物學家關心我們體內的機器是如何工作的，並透過測定蛋白質的原子結構來研究它的運作方式。除了許多其他重要的功能之外，蛋白質還能將糖轉移到細胞中、將氧氣從肺部運送到肌肉，以及在我們的大腦中產生電訊號。

要確定目標蛋白質結構的第一步是長晶（結晶成長）。幸運地，許多蛋白質可以排列成重複的三維模型來形成晶體。這種晶體的成長方式，是透過將純蛋白分離出來，並將其與多種鹽類及添加物混和，以迫使蛋白質形成小而有序的團塊，再向外生長成美麗的多面形狀，如圖1a所示。之後這些晶體會被一束X射線作結構分析。

在大型同步加速光源裡，強磁場加速著環形軌道中以相對論速度運動的電子。加速的電子發出廣譜的光。這種光源站是巨大的，周長通常為數百公尺。電磁波光譜在從這些環切線延伸出來的工作站被過濾，其中的X射線光束被用於實驗上。

放置在這些光束路徑中的蛋白質晶體將一小部分的X射線繞射到能記錄其影像—稱為反射的微小斑點，類似於封面圖像中顯示的那些—的探測器中。根據訊號的位置及強度，可以計算並建立蛋白質中每個原子的位置對應圖。

儘管晶體的培養是X射線繞射實驗的標準做法，但培養出足夠大的蛋白質晶體來進行研究可能需要數年的時間，或甚至完全失敗。這項瓶頸讓許多結構生物學家去尋找其他方法來鑑定蛋白質的結構。

低溫電子顯微技術的回顧

2017年的諾貝爾化學獎頒發給雅克．杜巴謝(Jacques Dubochet)、喬基姆．法蘭克(Joachim Frank)，和理察．韓德森(Richard Henderson)，以表彰他們開發在溶液中生物分子的低溫電子顯微技術(請見《今日物理學》2017年第22頁)。傳統的光學顯微鏡以玻璃透鏡將光聚集來放大小物體，這個方法會受限於只能用可見光的波長。相比之下，電子有著遠低於可見光的波長，甚至比典型的X射線波長還要短(請見圖1b)。而且由於它們同時帶有電荷及質量，電子可以被電磁透鏡加速到很高的速率。結果是：電子顯微鏡產生的影像細節，會遠比光學顯微鏡所能看到的還要精細。

圖1、晶體及其繞射。(a)透過光學顯微鏡看到蛋白酶K(proteinase K，一種絲氨酸蛋白酶)的蛋白質晶體。(b)圖中為常用於繞射實驗的X射線(藍色)與電子(橘色)的波長比較。電子憑藉其更短的波長，可以解析生物材料更精細的細節。

即便如此，要對微小的生物材料—像是單一個蛋白質—進行成像也是很困難的。高能量電子必須在真空中傳播，而這與液體環境—大多數蛋白質的天然家園—並不相容。且這些電子可能會破壞生物材料。為了避免這些問題，研究人員開發了能夠快地冷凍樣品的方法，使蛋白質的液體環境不能結晶。他們將蛋白質鑲嵌在一層薄薄的、無結晶的玻璃化（vitrified）冰中。冷凍的水合狀態存在於約-320°F的液氮溫度下，這樣的環境與電子顯微鏡是相容的。

在低溫電子顯微鏡發展快速冷凍技術之前，通常是專注於被培養成大二維晶體陣列的蛋白質上。對這些蛋白質進行成像需要將蛋白質晶體鑲嵌在其他的材料中（例如：糖），這些材料可以承受顯微鏡中的真空和具破壞力的電子束。在二維電子晶體學的首次演示中表明，可以從薄的蛋白質晶體中收集高解析度的繞射圖像，而無需使用水合階段將它們染色或固定（ref.2）。在該演示之後，是首次使用低溫電子顯微技術來冷凍蛋白質晶體，並將它們保存於天然水合狀態，以用於之後的電子繞射研究（ref.3）。

1975年，英國醫學研究委員會分子生物學實驗室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology）的理察．韓德森（Richard Henderson）及尼格爾．昂文（Nigel Unwin）提出了第一個三維結構模型，該模型利用電子晶體學，分別在7埃(Å)和9埃的解析度下，以葡萄糖鑲嵌稱為菌視紫蛋白(bacteriorhodopsin)的紫色膜蛋白，以及牛肝臟過氧化氫酶（bovine-liver catalase）的二維晶體（ref.4）。他們同時使用了成像及繞射。韓德森和昂文從傅立葉轉換中取得影像的相位，並將這些相位與在電子繞射圖案中獲得的振幅相結合。之後再將相位與振幅一起用於重建三維密度圖（ref.5）。為了實現這項成就，他們使用在室溫下操作的穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscope)來進行實驗。

1984年，杜巴謝和他的合夥人開發了一種藉由將生物樣品浸入液態乙烷來快速冷凍它們的方法（ref.3）。該方法將樣品與水冰凍得如此之快，以至於冰無法形成晶體，而形成玻璃化狀態。結果是冷凍的生物樣本得以保持其天然的水合狀態。這是樣品製備技術的一項進步，最終完成了從低溫保存二維晶體的電子晶體學中，獲得接近原子級解析度的菌視紫蛋白模型（ref.6）。在接下來的幾十年中，研究人員可以藉由使用低溫電子顯微技術與電子晶體學，來實現許多里程碑。

2005年，生物學家利用低溫電子顯微技術，得到了第一個近原子級解析度的蛋白質結構—在「雙層」二維晶體中的水通道蛋白-0（aquaporine-0）。為了看清楚該通道的結構，我們其中一位（Gonen）與合作夥伴仰賴於僅使用從不同傾斜角度記錄繞射圖案的電子晶體學。電子晶體學能辨別單層或多層的主要好處是，可以讓膜蛋白在其天然的環境中重組。這個過程讓研究人員能在雙層脂質中研究蛋白質的功能及相互作用。

來自微小三維晶體的繞射

一種類似的方法揭示了三維蛋白質晶體的結構（ref.8）。Gonen小組收集從溶菌酶（lysozyme)晶體不同角度得到的繞射圖案影像，並藉由分子置換來鑑定結構（請見《今日物理學》2006年三月份的第46頁，由Qun Shen、Quan Hao，以及Sol Gruner所寫的文章）。玻璃化的三維晶體產生類似於X射線繞射實驗的微小繞射斑點。

Gonen及其他人隨後修改了當晶體於電子束中旋轉時，在高速相機上記錄數據的方法（ref.9,10）。在這些情況下，該程序類似於大分子X射線晶體學中的標準旋轉方法，這可以更好更快地收集數據。在微晶體電子繞射實驗中的連續旋轉，從微小單晶中產生了更高品質的溶菌酶蛋白質結構。且能使用與X射線晶體學所使用的相同軟體輕鬆處理數據。微晶體電子繞射的數據被快速收集於低溫冷卻電子顯微鏡中，在低劑量條件下的連續旋轉玻璃化晶體（ref.1）。

在對溶菌酶和過氧化氫酶進行了初步微晶體電子繞射實驗—證明了該技術在結構生物學中的潛力—之後，研究人員接著從三維蛋白質晶體中解析出其他幾樣結構，包含各種膜蛋白以及配體結合的複合物（ref.11）。在過去的一年中，我們和兩位同事從溶菌酶的微晶體電子繞射數據中，展示了真正的原子級解析度（ref.12），如圖2所示。該展示為未來在亞原子級解析度的微晶體電子繞射研究中奠定了基礎。

圖2、亞原子級解析度的三斜溶菌酶晶體結構。這張電荷密度圖是從頭開始計算的。粉紅色圓球代表蛋白質原子(通常為碳、氮，以及氧)，綠色圓球為氫離子。這種品質的圖示能讓結構生物學家建立準確的蛋白質模型，以幫助藥物開發及設計。(改編自參考資料12)

電子晶體學在解析小的無機與有機分子結構上，也是有用的技術。當微晶體電子繞射實驗的研究人員採用了蛋白質二維電子晶體學的方法與技術時，其他研究人員正使用電子繞射法來顯現非玻璃化的抗輻射分子。結構生物學和材料科學的兩個世界在2018年發生了相遇，當時兩組人馬獨立地將電子繞射應用於小分子藥物的化合物上（ref.13,14）。

在我們兩人和幾位同事的實驗中（ref.13），低劑量條件是個常態。這些條件促進了從對光束敏感的有機分子中，快速收集繞射數據以及測定結構。製備是相對簡單的：可以將樣品壓碎或研磨成乾粉，然後直接放置在用於微晶體電子繞射的標準電子顯微鏡網格上。

在數據採集的過程中，網格暴露於電子束中，單個晶體可以被選擇去進行微晶體電子繞射分析。如果被分析的樣品包含多種化合物的混合，該過程可以讓研究人員直接從混合物中以原子級解析度識別不同的化合物（ref.13）。這項能力為天然物的研究，以及藥物化合物的描述提供了許多可能性。

電子讓我們看見了什麼？

分析微晶體電子繞射數據的研究人員使用的軟體，與分析X射線實驗的人員所用是一樣的。兩種方法都會產生一張圖，可以從圖中建構原子模型。雖然用來處理數據的軟體是一樣的，但從這些方法產生的圖中會提供不同的訊息。X射線從圍繞著原子的電子雲中散射，而電子是從原子的靜電位（electrostatic potential）散射，該靜電位是由正電荷與負電荷之間的交互作用產生（ref.15）。

因為每種實驗所使用的物理現象是不同的，在它們繪製的圖中所包含的資訊也會不一樣。X射線散射提供電子密度圖，圖中顯示了電子在晶體內部的位置。而電子散射會產生的是電位分布圖（ref.16)。該電位同時取決於元素及其電荷。局部環境會導致給定的原子有大不相同的散射幅度，如圖3所示。的確，電子繞射實驗能揭示胺基酸、離子、鹽類，甚至溶劑的電荷狀態。

圖3、中性原子和帶電原子的(a)X射線與(b)電子之間的散射差異。X射線是從原子的電子雲獨立散射，而電子是因電荷環境散射。在帶電原子中，可以看到散射的巨大差異。(c)酶(灰色)與藥物(藍色)結合的結構是由微晶體電子繞射測定的11。藉由這些繞射圖案，研究人員可以解析生物分子結構並篩選新藥，並辨別它們如何與不同的蛋白質結合。

美國食品藥品監督管理局（US Food and Drug Administration）批准的大多數藥物分子，是少於70個原子以複雜的三維形狀結合在一起。這些小的分子藥物通常是由碳、氮、氧，以及氫所組成。在任何給定的蛋白質或藥物，氫原子佔了所有原子中的50%。但很難從用同步加速X射線輻射的蛋白質和藥物繞射圖案中辨別出這些氫原子的位置。那是因為氫原子比其他元素還要輕很多，而且它們的電子雲很小。

儘管可以在極高質量的數據中看到這些原子，但大多數結構生物學研究無法達到能準確找到它們所需的解析度。相反地，氫原子被自動放置於理論上認為應該在的位置。使用電子散射可以讓生物學家以更適中的解析度辨別氫原子，因為與X射線不同的是，電子會從氫中強烈地散射。

透過破解這些氫在結構中的位置（ref.12,17），生物學家將能夠模擬藥物如何與有興趣的受體蛋白結合。較好的結合意味著能設計出療效更高、副作用更少的藥物。他們可以使用微晶體電子繞射技術快速確定這些藥物的結構。相比於嘗試事先培養藥物與蛋白質的晶體，生物學家能更高通量地確定藥物與目標蛋白結合的原子級解析度結構（ref.18）。藥物結合的靜電位圖直接顯示了結合的工作原理，以及電荷是如何相互作用的。在這方面，微晶體電子繞射有助於藥物發現的過程—藉由辨別藥物的結構，讓研究人員能了解它與蛋白質的相互作用。

微晶體電子繞射的未來

用於蛋白質和小分子的微晶體電子繞射技術的出現，替作為結構生物學儀器的穿透式電子顯微鏡創造了極好的價值。同樣的儀器可以用來使用單粒子和低溫電子斷層掃描，呈現大蛋白質及複合物的影像，也可用於微晶體電子繞射，從微小的晶體解析出原子結構，如圖4所示。僅使用一台穿透式電子顯微鏡，研究人員可以創造出完整的藥物發現流程。

圖4、實際上的低溫電子顯微鏡。(a)顯示300千伏的顯微鏡內部元件，包括(由上至下)一個電子源、平行電磁透鏡、一個低溫樣品空間和載物台(在放大圖中)，以及幾個拍攝系統。同一台電子顯微鏡可用於低溫電子顯微技術的所有模式。此處顯示了(b)單粒子分析、(c)低溫斷層掃描，以及(d)和低溫電子繞射的示例圖。在前兩種情況下，顯微鏡在成像的模式下運行，並根據記錄到的圖片計算結構。在最後一種情況下，顯微鏡拍攝晶體的繞射圖案，可以從圖中確定結構。(圖b改編自K. M. Yip et al., Nature 587, 157, 2020.，圖c改編自M. Pöge et al., eLife 10, e72817, 2021.)

探測電荷和可視化電位，而不是得到電子密度圖的能力並非微晶體電子繞射技術所獨有的。它是所有電子顯微鏡研究的特性。但事實證明，將樣品降至低溫對於探測生物材料的結構來說至關重要。的確，微晶體繞射技術開啟了結構生物學研究的新世界：定位氫原子、精確模擬電荷，以及確定奈米晶體的結構，這些都使該方法在許多研究中具有優勢。由此產生的數據可以為深度學習演算法提供解決蛋白質折疊問題的資訊，並提高其預測能力。（請見《今日物理學》2021年十月份的第14頁）總之，這些能力可以快速改進藥物的發現。使用該方法來確定其他任何方法都無法解析的分子結構僅僅是個開始。

除非另有說明，本文內容均在創用CC姓名標示4.0授權之下（CC BY 4.0 license）。

作者 Mike Martynowycz是科學研究家，Tamir Gonen是位教授。他們都在洛杉磯加利福尼亞大學（UCLA）的生物化學系中工作。

譯者 宋育徵 國立中央大學物理系助理

參考資料

1. B. L. Nannenga, T. Gonen, Nat. Methods 16, 369 (2019).

2. V. R. Matricardi, R. C. Moretz, D. F. Parsons, Science 177, 268 (1972).

3. J. Dubochet et al., Trends Biochem. Sci. 10, 143 (1985).

4. R. Henderson, P. N. T. Unwin, Nature 257, 28 (1975).

5. D. J. De Rosier, A. Klug, Nature 217, 130 (1968).

6. R. Henderson et al., J. Mol. Biol. 213, 899 (1990).

7. T. Gonen et al., Nature 438, 633 (2005).

8. D. Shi et al., eLife 2, e01345 (2013).

9. I. Nederlof et al., Acta Crystallogr. D 69, 1223 (2013).

10. B. L. Nannenga et al., Nat. Methods 11, 927 (2014).

11. M. T. B. Clabbers, A. Shiriaeva, T. Gonen, Int. Union Crystallogr. J. 9, 169 (2022).

12. M. W. Martynowycz et al., www.biorxiv.org/content/10.1101 /2021.10.16.464672v1.

13. C. G. Jones et al., ACS Cent. Sci. 4, 1587 (2018).

14. T. Gruene et al., Angew. Chem. Int. Ed. 57, 16313 (2018).

15. R. Henderson, Q. Rev. Biophys. 37, 3 (2004).

16. K. Yonekura, S. Maki- Yonekura, J. Appl. Crystallogr. 49, 1517 (2016).

17. L. Palatinus et al., Science 355, 166 (2017).

18. M. T. B. Clabbers et al., Commun. Biol. 3, 417 (2020).

本文感謝Physics Today (American Institute of Physics) 同意物理雙月刊進行中文翻譯並授權刊登。原文刊登並收錄於Physics Today 2022雜誌內 (Physics Today 75, 6, 38 (2022); https://doi.org/10.1063/PT.3.5019)。原文作者：Mike Martynowycz及Tamir Gonen。中文編譯：宋育徴，國立中央大學物理系助理。

Physics Bimonthly (The Physics Society of Taiwan) appreciates that Physics Today (American Institute of Physics) authorizes Physics Bimonthly to translate and reprint in Mandarin. Tamir Gonen and Mike Martynowyczand contributed to the article published in (Physics Today 75, 6, 38 (2022); https://doi.org/10.1063/PT.3.5019). The article in Mandarin is translated and edited by Y. C Sung, working at the Department of Physics, National Central University.