結構生物物理學方法在藥物開發的應用（下）

蛋白質的結構是在一定的實驗與環境條件 (造成例如磷酸化、醣化等轉譯後修飾，post-translational modification, PTM) 下才會有某些穩定的構形存在，而且在一般溫度壓力水溶液的條件下，蛋白質也是無時不刻不在運動的，那麼到底AlphaFold或是RoseTTAFold到底提供的是什麼樣的預測的結構呢？ 

我們實驗室因為最近與一位來自法國巴黎高等師範學院 (Ecole Normale Supérieure) 的訪問學者查理．鉤斯 (Charlie Gosse) 的合作，開啟了對一個知名的重要藥物雷帕黴素 (rapamycin) 及其相關蛋白的一系列生物物理探討，用到的生物物理工具包括單分子力譜 (single-molecule force spectroscopy)，NMR，小角度X光散射 (small angle X-ray scattering, SAXS)，生物層干涉儀 (BioLayer Interferometry, BLI)，以及分子動力學模擬，期能對這樣的系統得到比較全面的整合性瞭解。雷帕黴素最早是1975年由在復活島上的吸濕鏈黴菌 (Streptomyces hygroscopicus) 所分離出來的抗生素¹¹，後來在器官移植與抗癌等用途都得到FDA的核准。我們目前探討的其中一個課題是：為什麼2014年在用伊維莫司 (everolimu, 與雷帕黴素高度相似的藥物) 的臨床病人所發現的雷帕黴素機制標靶 (mechanistic target of rapamycin, mTOR) 上的雷帕黴素結合區域 (FKBP-rapamycin binding, FRB) 這個蛋白質上面的胺基酸從苯丙氨酸 (phenylalanine, PHE) 到白胺酸 (leucine, LEU) 的變化，會造成藥物與這個蛋白的作用消失¹¹？ 雖然這個抗藥性的蛋白胺基酸變化是2014年就發表的，但是至今尚沒有這個抗藥突變的蛋白的結構被決定出來。苯丙氨酸和白胺酸這兩個胺基酸其實都是物理化學性質類似的胺基酸，都是疏水性，其所在蛋白質結構上的位置也不是深埋的核心部分，何以在邊緣位置的這個胺基酸變化會造成對藥物結合這麼大的改變呢？ 這些有意思的問題引發我們去將這個結構決定出來的動機，而這個題目就很適合運用NMR來進行。目前在我們實驗室黃書毓博士的研究所指導教授就是前述黃太煌老師，最近在中研院基因體中心張七鳳老師的指導下，她非常有效率地將蛋白質表達與純化出來，並利用NMR的相關技術蒐集分析各種圖譜，最後運用NOE提供的原子間距離資訊及由NMR化學位移取得的胜肽鍵二面角 (peptide dihedral angle) 資訊，計算出如Figure 2 E所示的紫色的蛋白質結構。我們目前剛將新的蛋白質結構上傳至 蛋白質結構資料庫和生物核磁共振資料庫 (Biological Magnetic Resonance Bank, BMRB)。相信這樣的結構，對於設計新的藥物，可以不受前述抗藥性胺基酸的變化，會有相當重要的貢獻。

Figure 2  A.  最早發現雷帕黴素 (rapamycin) 所取得的鏈黴菌的復活島 (圖片取自維基百科)。B. 產生雷帕黴素的吸濕鏈黴菌 (Streptomyces hygroscopicus) (圖片取自維基百科)。C. 雷帕黴素的結構式。D. 雷帕黴素的三維結構。E. 有抗藥性的雷帕黴素結合區域 (FKBP-rapamycin binding, FRB) (紫色) 與野生型的FRB (灰藍色) 的結構比較。橘色與藍色部分是發生胺基酸變異的各自FRB蛋白第2108個胺基酸的位置。

回到前面一開始時所介紹的神經退化性疾病藥物的開發。前面提到我們目前在開發的藥物最早是由天麻中所萃取出來的化學分子，我們團隊中稱其為T1-11，其分子的結構就如Figure 3 E所示，而經過一連串化學合成修改後的目前我們在往臨床測試推進的分子，我們稱之為J4。我們團隊在2007年左右已經知道T1-11的主要藥理的作用分子機制是它會活化一個細胞膜的受體，人類腺苷A_2A 受體 (human adenosine A_2A receptor, hA_2AR)，同時它也會抑制一個細胞膜上的轉運蛋白，人類平衡性核苷轉運蛋白 (human equilibrative nucleoside transporter 1, hENT1)。像T1-11這樣同時擁有這兩種功能的分子在當時可以說是絕無僅有，我們覺得可以將自中藥的得到的這個分子當作上天賜給我們的靈感，接著循著這個方向，繼續設計與合成出更多的有此雙重特性的化學分子，然後從中挑選出藥物動力學 (pharmacokinetics) 性質還有生體可用率 (bioavailability)  較優異的分子，這就是前述的J4這個分子的由來。

中研院大概自2017年開始規劃要建置一個冷凍電子顯微術中心，添置一套當時最新型的電子顯微鏡。那時甫到任不久的廖俊智院長還在蔡元培館旁邊的會議廳辦一個討論會聽取大家的意見，看看大家是否支持並願意投入相關的工作，當天也的確看到大家真的覺得這是很值得投資的重大儀器設備。在蔡明道院士的大力支持與奔走，並以他所主持的台灣蛋白質計畫 (Taiwan Protein Project) 補足尚缺的一些經費，還有何孟樵老師的投入，現在位於我們實驗室所在的跨領域科技研究大樓B2的中央研究院冷凍電顯核心設施 (Academia Sinica Cryo-EM Facility)，自從2018年初建置以來，目前已經相當地上軌道。

運用冷凍電子顯微術建構原子解析度的生物分子結構的最末階段與用X-ray crystallography有點像，都是會先建出三維的電子密度圖 (electron density map)，去算出符合度最佳的生物分子的原子模型。但是如何得到這個電子密度圖的方法很不同。X光結晶學的話是要從繞射圖案 (diffraction pattern) 逆推，在數學上這算是一類逆問題 (inverse problem)，最大的挑戰是所謂的相位問題 (phase problem)：打在銀幕上的繞射圖像的相位資訊已經不見了。晶體的作用像是訊號放大器，因此品質越好與尺寸越大的晶體越有機會得到好的結構。而冷凍電顯則不一定需要得到生物分子的晶體，近來很多應用都是單粒子冷凍電顯 (single-particle cryo-EM)。這個領域最近得到革命性的突破主要歸功於基於互補式金屬氧化物半導體 (CMOS) 技術的直接電子偵測元件 (direct electron detector device, DDD) 的出現以及相關演算法的進展¹²。冷凍電顯的做法要得到電子密度圖則是先要得到生物分子在不同方位不同位置的平面的二維投影，藉由二維投影轉換成三維影像的計算轉換與依靠很大量的影像的疊合，最後得到高解析度的電子密度圖。

也因為冷凍電顯 (cryo-EM) 不需要大量的蛋白質也不需要尋找結晶條件，這對於非常難大量表達與非常難找結晶條件的膜蛋白就有很大的優勢，也因此我們實驗室自一年多前就開始投入在運用cryo-EM決定膜蛋白的結構，首選當然就是我們在進行藥物設計碰到的重要藥物標的。由於hA_2AR在活化狀態的結構已經被運用X光結晶學解出來了¹³，而且hA_2AR的促活分子 (agonist) 的化學結構過去探討的比較多，相較之下，hENT這類轉運蛋白是更值得投入更多的心力。我們實驗室在延聘到具有生化背景又對計算很有興趣的陳淵堯博士之後，在這個課題上已經有著可觀的進展。我們在這個課題上也得到中研院原子分子科學研究所的余慈顏老師和生物化學研究所徐尚德老師的諸多建議與協助。陳博士目前已經建立一系列相當複雜的蛋白質表達與純化之工作流程，並已獲得多種高純度之蛋白樣品，且已得到初步之冷凍電顯結構，如Figure 3 D所示，現在正往提升蛋白結構解析度推動進展。

Figure 3 A.  hENT1轉運蛋白在細胞膜分子模擬系統。B.  hENT1轉運蛋白與一個著名的抑制劑NBTI的結合情形。C. hENT1轉運蛋白與T1-11的結合情形。D.我們實驗室目前所得到到的低解析度的電子密度圖。E. T1-11的三維化學結構。

最近結構生物學有個重大突破的新聞：2021年7月15日自然科學雜誌與科學雜誌 (Science) 各自發表運用人工智慧深度學習 (deep learning) 預測蛋白質結構的重磅文章。前者是谷歌 (Google)2014年收購的英國深度心靈 (DeepMind) 這家人工智慧公司中的AlphaFold團隊的工作¹⁴，後者是華盛頓大學的大衛．貝克 (David Baker) 實驗室的RoseTTAFold的工作¹⁵，而兩者都是開放原始碼，因此對於想深度地學習最前沿的深度學習演算法的人來說，可以說是天上掉下來的最好的禮物。同時，對於想知道自己有興趣的蛋白質到底長什麼樣子的人，這兩者都提供了有很高正確率的預測結構。然而，既然讀者們已經讀到了本文的最後面，一定記得筆者之前提過，蛋白質的結構是在一定的實驗與環境條件 (造成例如磷酸化、醣化等轉譯後修飾，post-translational modification, PTM) 下才會有某些穩定的構形存在，而且在一般溫度壓力水溶液的條件下，蛋白質也是無時不刻不在運動的，那麼到底AlphaFold或是RoseTTAFold到底提供的是什麼樣的預測的結構呢？ 如果您可以想到這樣的問題，恭喜您已經了解本文的微言大義，對於本文所介紹的課題已經有了全面的掌握。首先，根據筆者初步的測試，AlphaFold的網站 (https://alphafold.ebi.ac.uk/) 提供的是給定胺基酸序列他們所預測的單一蛋白質結構。即使是在PDB上一個已經被解出許多構形的蛋白質，AlphaFold也只會提供一個構形。很多蛋白質的運動不是隨機亂運動 (stochastic random motion)，而是有生物意義 (biological significance) 的功能性運動 (functional dynamics)。例如前面介紹的拓撲異構酶對發生DNA的拓樸問題的部位，能切斷雙股DNA的一股並重新將斷掉的DNA接合，這種運動就是細胞複製過程不可或缺的蛋白質功能。再例如說細胞膜上的轉運蛋白 (transporters)，它們可以將細胞膜一側的分子或離子，搬運到細胞膜的另一側，在這個過程中這些轉運蛋白就需要變換構形以完成這樣的工作。

Figure 4 A.  葡萄糖轉運蛋白開口朝細胞內的構形。取自PDB ID: 6THA的結構所做的剖面圖。 B.  同A的構形與方位，但是用緞帶 (ribbon) 方式呈現結構。C.  葡萄糖轉運蛋白開口朝細胞外的構形。取自PDB ID: 4ZW9的結構所做的剖面圖。D. 同C的構形與方位，但是用緞帶 (ribbon) 方式呈現結構。E.& F. AlphaFold所預測的某種尚未有結構的葡萄糖轉運蛋白的構形。可看到AlphaFold所預測的構形是比較接近C & D，而不是 A & B。

雖然筆者這裡提到了目前AlphaFold或是RoseTTAFold的侷限，但是一般結構生物學實驗方法面臨的情形並沒有好多少，而且這些預測方法的結構精細度的確都非常高，運用這樣的結構來進行藥物的虛擬篩選 (virtual screening) 還是有一定的機會。在今年這兩個里程碑式的工作發表之後，相信將來基礎科學的研究的投入會更多是在沒有較固定構形的本質性無序蛋白 (intrinsically disordered proteins, IDPs)，或者蛋白質中含有重要的本質性無序區域 (intrinsically disordered region, IDRs) 的情形。在筆者目前進行的新藥開發合作題目中，已經有許多藥物標靶是這類的蛋白質，目前大多數是以生物資訊計算與分子模擬方式來進行，未來則有待更多創新的實驗方法的開發。

參考文獻：

1. Wagle, N., et al. Response and Acquired Resistance to Everolimus in Anaplastic Thyroid Cancer. N. Engl. J. Med. 371, 1426-1433 (2014).
2.  Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P.A. & Walz, T. A Primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell 161, 438-449 (2015).
3. Ye, L.B., Van Eps, N., Zimmer, M., Ernst, O.P. & Prosser, R.S. Activation of the A_2A adenosine G-protein-coupled receptor by conformational selection. Nature 533, 265-+ (2016).
4. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature (2021).
5. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science, eabj8754 (2021).