基因「剪刀」：一個可以編寫生命密碼的工具

艾曼紐·夏彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier) 與珍妮弗·道德納(Jennifer Doudna)因發現CRISPR/Cas9的強大基因編輯技術，一同榮獲2020年諾貝爾化學獎。

科學家們可以藉由CRISPR/Cas9精準地改變動物、植物，以及微生物的DNA。這項技術徹底改變了分子生命科學，為植物育種帶來了新的機遇，並有助於開發新的癌症療法，另外也使治癒遺傳性疾病的夢想有機會成真。


科學之所以吸引人，其中一項原因在於它的不可預測性 ─ 我們永遠不會提前知道一個想法或是問題會帶領我們到什麼樣的境地。有時候好奇心會讓我們陷入死胡同，有時候會讓我們走進需要花很長時間才能破解的複雜迷宮。但這次她知道，她將幸運地成為第一位發現這項無限可能的人。


名為CRISPR-Cas9的基因編輯器是一項具有驚人潛力的意外發現。一開始，艾曼紐·夏彭蒂耶與珍妮弗·道德納認為可以開發出新的抗生素，而對鏈球菌屬(Streptococcus)的免疫系統進行研究。但最後她們卻發現這項可以精準剪裁基因的分子工具，使科學家能更簡便地改變生命密碼。

可以影響所有生物的強大工具

這把基因「剪刀」在被發現的僅八年後，就徹底改變了生命科學領域。如今的生化學家及細胞生物學家可以輕鬆地研究不同基因的功能，以及它們在疾病上所扮演的角色。在植物育種方面，研究人員可以賦予植物特定的表徵，例如：可以在較溫暖的環境下具有抗旱能力。在醫學上，這項基因編輯器可幫助開發新的癌症治療技術，另外也是治療遺傳性疾病的第一項研究。


CRISPR/Cas9上應用的例子不可勝數，其中還涵蓋了不道德的使用程序。與所有強大的技術一樣，一些道德規範也需要因應這項基因「剪刀」而生。但這部分我們留到之後再細講。

 

在2011年，艾曼紐·夏彭蒂耶與珍妮弗·道德納都不知道她們在波多黎各(Puerto Rico)咖啡廳裡的第一次會面是改變她們人生的轉捩點。在這裡，我們將從最初提出合作的人開始講起：艾曼紐·夏彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)。


夏彭蒂耶深深為致病菌所著迷


有些人形容她執著、細心，且觀察透徹。其他人則說艾曼紐·夏彭蒂耶總是追求不可預測的東西。而夏彭蒂耶則引用一段路易·巴斯德(Louis Pasteur)的話來形容自己：「機會是留給準備好的人」。追求新發現的執著以及對自由和獨立的渴望主宰著她的人生道路。包括在巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur)的博士學位學習在內，她曾在五個不同國家、七個不同城市居住過，並曾在十個不同的機構中工作。


她的研究環境和方法隨著時間推移，但她大部分的研究都有一個共同的主角：致病菌(pathogenic bacteria)。它們為什麼侵略性這麼強？它們如何發展對抗生素的抗藥性？我們是否有機會找到新的治療方法去阻止它們發展出抗藥性？


在2002年，當艾曼紐·夏彭蒂耶在維也納大學(University of Vienna)成立她自己的研究團隊時，她致力於研究其中一種會對人類造成極大危害的細菌：化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)。化膿性鏈球菌每年感染數以百萬計的人，常常引起一些易於治療的感染性疾病，像是扁桃體炎和膿皰瘡。但它也能引起具有生命危險的敗血症，並破壞體內的軟組織，使其具有「食肉者」的惡名。


為了對化膿性鏈球菌有更進一步的認識，夏彭蒂耶對這隻細菌調控基因的機制展開徹底的研究。而這個決定成為了發現基因剪刀的第一步。但在這個故事開始之前，我們先來認識一下夏彭蒂耶的合作夥伴：珍妮弗·道德納(Jennifer Doudna)。因為當夏彭蒂耶正對化膿性鏈球菌進行詳細的研究時，道德納第一次得知一個聽起來像crisper的縮寫。


科學 ─ 擁有與偵探的故事一樣多的冒險

即使是一個在夏威夷長大的小女孩，道德納對於新知有著強烈的渴望。有一天，道德納的父親把詹姆斯·華生(James Watson)的書《雙螺旋》《The Double Helix》放在她床前。這本偵探風格的故事，講述著詹姆斯·華生(James Watson)與弗朗西斯·克里克(Francis Crick)如何發現DNA分子結構的故事，這是道德納在教科書上從來沒有看過的內容。她被科學研究的過程深深吸引，並意識到科學並非單純的只是陳列事實而已。


但當道德納開始進行科學研究時，她所關注的並不是DNA，而是在分子結構上與它相似的雙胞胎兄妹：RNA。當我們在2006年見到道德納的時候，她的研究團隊正在柏克萊加利福尼亞大學(University of California, Berkeley)進行著已有二十年的RNA相關研究經驗。她以成功的研究人員而聞名，擅長進行突破性的探索，而最近她又進入了一個激動人心的新領域：RNA干擾(RNA interference)。


多年以來，科學家們一直認為他們已經了解RNA的基本功能，但卻突然發現在細胞中還有許多小的RNA分子(small RNA)，可幫助調控細胞中的基因活性。正因為珍妮弗·道德納進行著與RNA干擾相關的研究，使得她在2006年接到一通從不同部門的同事打來的電話。


細菌有著古老的免疫系統

道德納的同事是一位微生物學家，他告訴道德納一項新的發現：當研究人員把彼此間差異甚遠的細菌，以及古細菌(一種微生物)的遺傳物質放在一起比較時，他們驚訝地發現有一段高度保守的重複性DNA序列。這些相同的特徵序列一遍又一遍地重複出現，但又在這之間穿插了一些獨特的基因片段(見圖二)。就好比在一本書裡面，相同的單詞不斷地重複出現在不同的句子裡。

 

這些重複的序列被稱為常間回文重複序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，簡稱CRISPR。有趣的是，穿插在CRISPR中的那些非重複性、獨特的基因片段似乎能與各種病毒的遺傳密碼相匹配，因此目前推測這是細菌與古細菌用於保護自己免於受病毒侵害的一種古老免疫系統。目前的假設是，倘若一隻受病毒感染的細菌能成功地存活下來，它會將一部分的病毒基因片段添加到自己的基因組中，作為其免疫系統的記憶。


她的同事說，目前還沒有任何人知道這一切是如何進行的，但推測細菌用來抵抗病毒感染的機制類似於道德納所研究的RNA干擾機制。

道德納掲露了此複雜機制的神秘面紗


這消息受到了大家的關注且又令人振奮。倘若細菌真的有此古老的免疫系統，將會是一項重要的發現。這喚起了道德納的好奇心，她開始學習與CRISPR系統有關的一切知識。


另外，除了CRISPR序列，研究人員還發現了與CRISPR有關的特殊基因，被稱為CIRSPR-associated gene，簡稱cas基因。道德納發現有趣的是，cas基因與那些專門用來解開DNA、剪切DNA的已知蛋白的基因序列非常相似。這麼說，Cas蛋白是否也具有相同的功能？它們是否能切割病毒的DNA？


道德納帶領的團隊著手進行研究，幾年後，他們成功發現了幾種不同Cas蛋白的功能。與此同時，在其他大學的少數研究小組也正探究著新發現的CRISPR/Cas系統。他們的研究結果顯示了細菌有著不同的免疫形式。道德納所研究的CRISPR/Cas系統屬於第一類，這是一項複雜且需要許多不同Cas蛋白參與來清除病毒的免疫機制。第二類的免疫機制相較起來就非常簡單了，因為在這其中參與的蛋白質更少。而就在地球的另一端，艾曼紐·夏彭蒂耶的研究正面臨著這樣的免疫機制。讓我們將故事再帶回到她身邊。


在CRISPR系統之謎中，新穎且未知的一隅

在2009年，艾曼紐·夏彭蒂耶移居到位於瑞典北部的于默奧大學(Umeå University)。在那裡，她得到了一份很好的研究機會。雖然是在遠離世界的偏遠角落，漫長且昏暗的冬天讓艾曼紐·夏彭蒂耶能有安靜的空間與平靜的心情專注於她的研究。


而她正需要像這樣幽靜的環境。對調控基因的小RNA分子同樣也充滿好奇的夏彭蒂耶與柏林的研究人員合作，將在化膿性鏈球菌中發現的小RNA進行了基因定序。定序的結果提供了她很多值得思考的面向，因為在這種細菌裡大量出現了某個未知的小RNA，而經過比對發現這段RNA序列與細菌基因組中的CRISPR序列十分相似。

未知的小RNA與細菌基因組中CRISPR序列的相似性使夏彭蒂耶認為這兩者之間是有關聯的。將兩者經過仔細地比對，發現未知RNA有一部分能與CRISPR的重複序列相匹配。就像找到兩塊能完美拼合的拼圖塊一樣(見圖二)。

夏彭蒂耶從未對CRISPR進行過研究，但她的研究團隊開始對化膿性鏈球菌的CRISPR系統進行檢測。這項系統屬於細菌的第二類免疫機制，科學家們已經知道它僅需一個稱作Cas 9蛋白的Cas蛋白，即可切除病毒的DNA。而夏彭蒂耶另外發現一個未知的RNA分子，叫做反式激活crispr RNA(trans-activating crispr RNA, tracrRNA)，在此機制中同樣也具有重要的功能。tracrRNA可以將自CRISPR轉錄出的長條RNA轉變為成熟且具有功能的形式(見圖二)。


經過深入的鑽研，夏彭蒂耶在2011年三月發表了她在tracrRNA上的研究。她知道自己正經歷著激動人心的時刻。她在微生物學方面擁有多年的經驗，並希望在未來繼續研究CRISPR/Cas9系統的道路上能與生化學家合作。珍妮弗·道德納便是她的萬中之選。因此，在那年春天，當夏彭蒂耶受邀在波多黎各舉行的會議中講述她在tracrRNA上的發現時，便期盼著能藉此機會與這位經驗豐富的柏克萊研究人員會面。


在波多黎各咖啡廳中，一場改變人生的會面

在會議的第二天，她們在一家咖啡廳巧遇，透過道德納同事的介紹認識了彼此。隔天，夏彭蒂耶邀請道德納一同探索這座古老的城市。她們在鋪著鵝卵石的街道上悠閒地漫步，一邊談論著彼此的研究。夏彭蒂耶想知道道德納是否有興趣一起合作，詢問是否有興趣參與化膿性鏈球菌第二類免疫系統中Cas9功能的研究？


珍妮弗·道德納對於Cas9功能的研究非常感興趣，於是她們的研究團隊透過視訊會議擬定了研究計劃。他們假設CRISPR-RNA可用於辨認病毒的DNA，而Cas9則是作為切斷病毒DNA分子的剪刀。但當他們針對此假設設計實驗，進行體外測試時，卻什麼事情都沒有發生，DNA分子依舊保持完整。為什麼會這樣？是實驗條件上的問題？還是Cas9的功能與他們的假設天差地遠？


經過大量的腦力激盪以及許多的失敗實驗，研究人員終於將tracrRNA加入他們的實驗條件中。在此之前，他們認為只有當CRISPR-RNA轉變成具有活性的形式時才需要tracrRNA的參與(見圖二)，但一旦Cas9獲得了加入的tracrRNA，每個人都引頸期盼的事情發生了：DNA分子被切割成兩個片段。


演化的成果通常會使研究人員感到驚訝，但這次卻非比尋常。鏈球菌所具備用來抵禦病毒侵害的武器既簡單又有效，甚至是出類拔萃的。基因剪刀的演變歷史可能就此止步，夏彭蒂耶與道德納發現了細菌上一直困擾著人類的基本機制。這一發現本身就驚為天人，但機會總是留給準備好的人。


一個劃時代的實驗

研究人員試著簡化這把基因剪刀。藉著他們在tracrRNA及CRISPR-RNA上得到的新知識，將兩者融合成一個分子，並稱它為導引RNA(guide RNA)。研究人員利用這把經過簡化的基因剪刀，進行了一項劃時代的實驗：他們想知道能否隨心所欲地控制這把基因剪刀，去切斷他們所指定的DNA特定位置。


走到這一步，研究人員知道他們已與重大的突破相去不遠。他們在道德納的實驗室中取得一段已知的基因，並在其上選定了五個特定的切點。接著，他們更改了基因剪刀上的CRISPR序列，使其能與欲切斷的DNA位點相匹配(見圖三)。最後這項實驗有著壓倒性的結果：DNA分子確實在正確的位置上被切斷了。


翻轉生命科學的基因神器

在艾曼紐·夏彭蒂耶與珍妮弗·道德納於2012年發表她們的CRISPR/Cas9研究後不久，有其他幾個研究小組證明了該工具可用於修飾小鼠和人類細胞中的基因，開啟了CRISPR/Cas9爆炸性的發展。在此之前，要改變細胞、植物，乃至於生物體中的基因是非常耗時的，有時甚至是不可能的。如今，理論上來說研究人員可以利用基因剪刀在任何他們所指定的DNA位置上做剪切，再透過細胞與生俱來的DNA修復系統改寫生命密碼。


這項編寫基因的工具如此的方便，使它被廣泛地使用在基礎研究中。它被用於改變細胞和實驗動物的DNA，以了解不同基因的功能以及其相互之間的關聯，例如用在研究疾病發展的過程。


在植物育種方面，基因剪刀也被廣泛地使用。從前用於修改植物基因的方法通常需要用到具有抗生素抗性的基因。這使在種植基改作物時，存在抗藥性擴散到周圍微生物而造成基因汙染的風險。如今有了基因剪刀，研究人員可以對基因組進行非常精確的改變，不再需要使用那些較舊的方法。舉個例子，研究人員改變了水稻的基因，使水稻能吸收土壤中的重金屬，從而降低土壤中鎘和砷的含量。

此外，人們還開發出了能夠在溫暖的氣候下抵抗乾旱的作物，另外也有抵抗昆蟲和害蟲的基改作物，進而減少殺蟲劑與農藥的使用。


為遺傳疾病的治療燃起了一線希望

在醫學上，基因剪刀可用於開發治療癌症的新免疫療法，目前已在測試階段，可望能使遺傳疾病被治癒的夢想成真。如今研究人員正進行著臨床試驗，研究是否可以利用CRISPR / Cas9來治療血液相關的疾病，像是鐮狀紅血球貧血症和β地中海型貧血，以及一些遺傳性的眼部疾病。


甚至在大器官(如大腦和肌肉)的修復上，似乎也能運用這個基因療法。透過動物實驗結果發現，經過特殊設計的病毒可以將基因剪刀送入特定的細胞中，從而治療一些嚴重的遺傳性疾病，例如肌肉營養不良症、脊髓性肌肉萎縮症，和亨丁頓舞蹈症等。不過這些技術在用於人體測試之前，都還需要再經過更進一步的改良。


強大的基因編輯技術與其規範

古人云：「水能載舟亦能覆舟」。CIRSPR基因編輯技術如此好用，卻也存在著被濫用的風險，例如被用於創建基因改造胚胎。但是多年以來，人們已建立了大大小小的法規來控制基因工程的應用，其中包含在改變人類基因時，禁止有改變基因遺傳至後代的可能。另外，在進行涉及人類與動物的實驗之前，都必須先得到倫理委員會的審查和批准。

我們可以肯定的是，這把威力強大的基因神剪深深地影響著所有人。我們將面臨新的倫理道德問題，但是這項新工具也有助於解決人類目前所面臨的許多挑戰。艾曼紐·夏彭蒂耶與珍妮弗·道德納的新發現，帶領生命科學領域進入一個全新的時代，並開拓了人們的視野。將來，當我們繼續探索著這片新的領域時，確信會有新的意外發現。