專業 物理

結構生物物理方法在藥物開發的應用(上)

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撰文者:林榮信研究員
發文日期:2021-09-15
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  • 在2021 年4 月29 日下午在科技部舉辦了一個很特別的腦科技規劃的跨司會議,主席為科技部林敏聰政務次長與生科司的陳鴻震司長,人文司的林明仁司長、工程司的李志鵬司長,以及自然司的羅夢凡司長也都參加了,這個別開生面的會議有兩位主持人,分別是中央研究院分子生物研究所的孫以瀚特聘研究員,以及長庚生物醫學轉譯研究所的華瑜講座教授,共同與會的還有其他20 位的學術界與產業界的專家。這個會議的目的是來討論2023 年的腦科技計劃的規劃,期望在國內目前所累積的腦科技的研究能量的基礎下,進一步將所開發具有競爭力與利基點之技術繼續做應用與推廣,並推動腦疾病之精準健康,以刺激我國生技產業之創新與發展。孫以瀚老師首先做了一個簡短的規劃報告,而為了凝聚共識,報告中他引用了2019 年甫過世的西德尼· 布瑞納(Sydney Brenner)的著名的一段話:”I will ask you to markagain that rather typical feature of the development of our subject; how so much progress depends on the interplay of techniques, discoveries andnew ideas, probably in that order of decreasing importance.” 這段話是出於1980 年3 月20 日西德尼· 布瑞納受邀在瑞士巴賽爾的弗雷德里希·米歇爾研究所(Friedrich Miescher Institute)成立十周年慶的致詞。孫老師引用這段話對這個跨領域的會議來說無疑是非常恰當的,顯然是期望自然司與工程司有更多的老師可以投入與參與,大家共同聚焦在這個非常重要、也非常吸引人的腦科學這個領域。4 月21 日物理雙月刊的副主編羅健榮老師邀請我來寫一篇有關計算藥學的文章,我那時欣然答應,不過還沒有具體寫作的方向,約一個星期後的這個會議觸發了我一些可以寫進去的題材。


    目前我們實驗室在中央研究院生物醫學科學研究所陳儀莊老師所主持的總計畫「通過改善腦能量流失來治療阿茲海默症」所要進行的工作我想值得來為大家介紹一下。這個今年開始的計畫就是一項上面所提到的科技部所支持的腦科學計畫。我們實驗室在這個子計畫中所要進行的是運用結構生物學與計算的方法,來進行新穎藥物的設計。

    有關於我們團隊新藥開發的工作,2013 年時,《科學發展》的特約文字編輯吳美枝小姐曾以標題「中藥西用新魔彈」來專文介紹,發表在當年6 月第486 期75-76 頁。簡單來說,我們團隊是根據在《神農本草經》就有記載的上品中藥天麻中找到的新的有效成分,運用計算的方式與一系列的化學修飾進而得到新穎的化合物。目前我們在中研院智財技轉處的協助下,已經有了相當程度的專利佈局,主要的化合物也通過了進入臨床測試所需要的部分毒理測試,證實安全無虞,近期也已經進行到下一步動物實驗所需的化合物量產。雖然已經進行到這個階段了,但是在藥物開發的標準流程中,還是需要有其他的候選藥物,所以持續開發新的藥物分子仍是我們團隊應該繼續去做的事情。此外,我們的藥物在蛋白質分子上真正的結合模式 (binding mode),也有待進一步結構生物實驗的確認。早期的藥物開發,很多時候並不知道藥物作用的蛋白質是什麼或是哪段DNA 或 RNA。例如很多奈米醫學(nanomedicine)在癌症的應用例子中,很多人用阿黴素這個藥物 doxorubicin(早期這個藥物被 喚做adriamycin)。阿黴素最早是在1967 年由一家義大利的藥廠法米塔利亞研究實驗室(Farmitalia Research Laboratories)從一種Streptomyces peucetius var. caessius 的鏈黴菌所分離出來的[1]。那時找到這樣的藥物主要是依靠細胞實驗,接下去再進行動物的藥理與毒理實驗,最後再進入臨床實驗。直到1984 年,阿黴素在分子層次的藥理的作用標的與機制才被劉昉院士(Leory F. Liu,中央研究院第23 屆院士)的實驗室找出。他們發現這個藥物作用在細胞複製及生長過程中,一種關鍵的分子馬達酵素蛋白,叫做第二型拓撲異構酶(Type II topoisomerase),它能切斷雙股DNA 並重新將斷掉的DNA 接合以解決DNA 的拓樸問題(topological problem)。此時如果阿黴素介入作用,則會與第二型拓撲異構酶形成三個分子結合在一起的切割複合物(cleavage complex)。這個由三個分子所結合成的大分子團,則會進一步引發了癌細胞的細胞凋亡(apoptosis)[2] 而達到殺死癌細胞的效果。 雖然像阿黴素這樣五十多年前開發出來的藥物到現在在臨床上還是廣為應用,但近來藥物探索的做法卻已經有了很大的改變,促成這個改變的最主要原因便是生物分子結構在過去三、四十年間的大大充實,我們可以看到現在在蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank, PDB) 上的生物分子的結構也已經超過180,000 個。圖一C 所顯示的DNA 第二型拓撲異構酶與DNA 和藥物結合的結構就是在2011 年時,首度由臺灣大學醫學院生物化學暨分子生物所的詹迺立老師團隊,運用X光晶體學(X-ray crystallography)所決定出來的。這項研究成果讓我們可以在原子的解析度下,親眼目睹那個第二型拓撲異構酶在切斷雙股DNA 瞬間,與藥物形成切割複合物的特定狀態的分子結構。


     
    截圖 2021-09-15 上午9.59.00
     
    圖一:A. Doxorubicin 的三維結構,取自LigandExpo(DM2_model.pdb)。
    B. 兩個doxorubicin分子嵌入在一段DNA之中。結構取自Protein Data Bank( PDBID:1d12[3])。
    C. Doxorubicin 分子正要進入 DNA topoisomerase II 已剪斷雙股DNA 的一股,形成cleavage complex 的結構。修改自Protein Data Bank 的結構(PDB ID:3qx3[4])。


    整個結構生物學這個領域的演進可以說與上個世紀初以來的物理學發展息息相關。1901 年第一屆的諾貝爾物理學獎單獨頒給倫琴(Wilhelm Conrad Röntgen),得獎理由是「以表彰他所發現並隨後以他名字命名的非凡射線所做出的卓越貢獻。」(in recognition of theextraordinary services he has rendered by the discovery of the remarkablerays subsequently named after him.),單純地因為他發現了倫琴射線,通稱的X光(X-ray)。這一點呼應了我一開始時提到的西德尼· 布瑞納的那段話中所強調的技術或工具對科學進展的核心重要性。倫琴1895年發現X光的時間點,也正是約翰· 海賽爾(Johan Hessel)、奧古斯特· 布拉費(Auguste Bravais)、葉夫格拉夫· 費奧多羅夫(Evgraf Fedorov)、亞瑟· 莫利茲· 荀弗利斯(Arthur Schönflies)及威廉· 巴洛(William Barlow)等人剛完成對晶體對稱的探討的時候。


    在倫琴發現X-ray 接下去十餘年間,不少科學家投入與X光相關的實驗與理論工作。1912 年1 月保羅· 伊伐德(Paul Ewald)與馬克斯· 勞厄(Max Laue)在慕尼黑著名的英國花園散步聊天時,伊伐德提到他的博士論文中會提出一個晶體的共振模型,但這樣的模型沒有辦法用可見光來印證,因為其波長太長了。勞厄就想到應該可以用比可見光波長短得多的X光來探討晶體的結構。其實早在1899 年時兩位荷蘭物理學家何曼努斯· 哈軋(Hermanus Haga)和孔涅黎斯· 溫德(Cornelis Wind)就已經發表了他們X光繞射的工作,也估計了X 光的波長約是1 埃(Å)。伊伐德的博士論文指導教授阿諾· 索莫菲爾德(Arnold Sommerfeld)還在1912 年發表某種X 光的繞射的分析,結論是其波長應該不大於0.4 Å。勞厄有了這個想法不久後就趕快著手進行實驗,他當時選用的是硫酸銅的晶體,1913 年3 月15 日將這個工作的論文送到德國的物理年刊(Annalen der Physik)發表。而因為這個絕妙的想法所引發的實驗,馬克斯· 馮· 勞厄(Max von Laue)就單獨獲得了1914年的諾貝爾物理獎。稍早之前,1912 年英國的父子檔物理學家威廉·亨利· 布拉格(William Henry Bragg)與威廉· 勞倫斯· 布拉格(William Lawrence Bragg)也有著類似的想法,而後者提出了著名的布拉格定律(Bragg’s law),非常簡明地讓我們瞭解入射波長與晶格間距和散射角的關係,這個結果首次的公開發表是在1912 年11 月在劍橋的一個會議。1913 年他們在英國自然雜誌(Nature)發表了鑽石的結構,然後1914 年發表了銅晶體的結構。布拉格父子也因為對於晶體結構的分析工作獲得了1915 年的諾貝爾物理學獎。這些重要的創新突破引起後來這個領域的快速發展,可以想見接下去一路由簡單的原子組成的晶體、離子晶體、有機分子的晶體(第一個這樣決定出結構的是六亞甲基四胺
    (Hexamethylenetetramine)), 然後到DNA 與蛋白質的晶體(第一對被解出結構的蛋白質是血紅素(haemoglobin)和肌紅素(myoglobin))。運用X-ray 繞射的實驗,加上理論與計算方法的進展,讓我們對於化學鍵與非共價鍵交互作用有了越來越清楚的瞭解。

    大家知道路易德· 布洛伊(Louis de Broglie)在1924 年的博士論文中提出了物質波的概念,他的指導教授保羅· 朗者萬(Paul Langevin)為求小心起見,將一份論文初稿寄給了愛因斯坦(Albert Einstein)請他惠賜意見,而後者給了這篇博士論文極高的讚譽,讓德· 布洛伊得以順利獲得博士學位,論文也於1925 年發表在法國的物理年刊(Annales de Physique)。薛丁格(Erwin Schrödinger)讀到這篇文章後,嘗試去回答這樣的物質波的波動方程式是什麼,於1925 年下半年開始構思此方程式,1926 年1 月發表在德國的物理年刊他的第一次波動方程式的推導以及計算氫原子的能階的劃時代的重要文章:「量子化之為固有值問題」(”Quantisierung als Eigenwertproblem”)。在相對論不需要被引進來的情境下,基本上薛丁格方程式(Schrödinger Equation)是所有物質與分子的理論計算的終極基礎,然而因為直接用這個方程式來算的代價太昂貴,即使是用了現在世界上最快的超級電腦,我們還是只能用來處理很小很簡單的系統,也不能用來計算這樣的系統稍微長一點時間下的變化。用所謂的蛋白質摺疊問題(the protein folding problem)來舉例,一個蛋白質的結構,應該是在可以讓它穩定的實驗條件下熱力學自由能最低的狀態,而照理講我們其實可以從任意一個結構開始,先建構一個那樣的實驗的條件(例如:溶解在足夠多的水分子中與給定正確的酸鹼值)的原子分子系統,再運用週期邊界值條件(periodic boundary condition, PBC)開始進行薛丁格方程式的長時間的計算,然後我們應該就會自動看到這個蛋白質逐漸從隨意無序的結構變成上一段提到的X 光結晶學的方法所得到的結構。我們碰到的實際的問題是:這樣的原子分子系統只要稍大一點,例如超過幾十個原子,如果堅持要用薛丁格方程式來處理這樣的系統,我們的計算機就可能因為記憶體不夠算不動,而正因為計算所需花費的時間很多,因此系統可以計算達到的時間尺度也可能連奈秒(nanosecond, 10−9s)都達不到。我們不敢講未來計算機可以有何等的進展,但在我們還看不到確實可用的新計算機結構出現之前,我們必須去思考可以合理簡化的可行計算做法,同時理想上希望在這計算的架構中,薛丁格方程還是底層的物理基礎。這就是某些現在廣為運用的分子力場(force field molecular mechanics)為作用力計算的分子動力學模擬(molecular dynamics simulation)的思想根源。


    為什麼分子動力學模擬很重要?以蛋白質分子為例,因為我們需要將這個蛋白質分子所處的溫度、壓力、溶劑、以其他重要相關分子都放在同一個系統中,這個蛋白質最後才會表現出它所對應的實驗條件那樣的功能,而僅光是溫度與壓力的模擬就需要系統中各個原子的速度與作用力資訊,而這樣的資訊很難由實驗去得到。當我們可以在可接受的精確度下進行分子動力學模擬,我們便可以超越十九世紀末路德維希· 波茲曼(Ludwig Boltzmann)因為沒辦法描述原子分子間的作用力的侷限:當年他僅能探討簡單的幾近無交互作用的理想氣體,而我們現在則可以處理一百多年前幾乎無法想像的複雜流體,甚至是生物分子的系統。在原子的尺度下,去觀察各式各樣的生物分子是怎麼樣完成它們的工作;而且不只是觀察,理論與模擬的分析還可以提供系統中能量是怎樣的分布與流動。以前面提到的第二型拓撲異構酶的功能為例,我們可以問:如果將卡在蛋白質與DNA 間的藥物移除,我們是否可以看到這個拓撲異構酶繼續去執行它未完成的工作?

    我們在2014 年左右開始進行這樣系統的分子動力學模擬,整個建構的系統含有超過20萬個原子,藉由高效能的圖形計算單元(graphical processing unit, GPU),我們使用自己實驗室的計算伺服器就可以模擬這麼大的系統,而且達到微秒(microsecond, μs, 10−6s)的時間尺度。果不其然,在這麼長的時間尺度的精心準備的分子動力學模擬中,我們可以目睹這個拓撲異構酶逐漸地將斷掉的DNA 往癒合的方向接回去,而這個過程中間,DNA 的構形(conformation)變化也符合過去的相關實驗的推測[5]。回到藥物設計這樣的應用領域,我們如果可以藉由波茲曼的統計力學,自微觀的分子動力狀態算出巨觀的藥物分子與藥物標靶蛋白質分子的結合自由能,更進一步分析藥物分子中各原子在結合中的貢獻,看看如何將某些原子替代掉是否可進一步增強結合自由能,並探索原藥物分子結合位置附近,是否還有適合空間可以做為原藥物分子的修改與延伸的可能,這都會是物理可以應用與發揮的地方。


    物理的訓練可以在上述的許多階段更精確地確認所採取的簡化與逼近是否合理,並在許多可能被忽略與錯待的關節上提出修正的做法。我們實驗室在兩年前提出一個基於分子動力學模擬及變分法原理的新的自由能計算方法[6],就是因為鑑於過去的計算方法有些思考的盲點,加上分子動力學模擬是相對昂貴的計算,限縮了比較正確合理作法的廣泛探討。雖然我們這篇文章投稿階段被其中一位評審稱讚道我們的方法非常具吸引力(very compelling,或譯作非常具激勵性),但我們自己知道未來還有許多可以努力的空間。

    結構生物這個領域的誕生與物理人還有另一層關係。1938 年是薛丁格顛沛流離的一年,而因為納粹的關係,他被迫離開當時任教的格拉茲(Graz)大學,後來輾轉先逃到義大利,接著在英國的牛津與比利時的根特(Ghent)訪問,最後接到愛爾蘭都柏林那邊的邀請,希望他能去那裡協助創立一個所:都柏林高等研究院(Dublin Institute for Advanced Studies)。在都柏林期間,於1944 年時他寫了一本小書:「生命是什麼?」(“What is Life?”)在這本書中他可說是上窮碧落下黃泉地探索生命之所以可能的物理及化學的基礎,也擬想了遺傳訊息應該存在於物質分子之中。事實上這本書深刻地影響了華生(James Watson)與克里克(Francis Crick),對他們的研究生涯的轉折都有著關鍵的影響,最終讓DNA 的雙螺旋結構可以在1953 被他們兩位給決定出來,而這時他們工作的卡文迪許實驗室(Cavendish Laboratory)的所長,正是前面提到過的威廉· 勞倫斯· 布拉格。也是在這裡1960 年馬克斯· 皤魯茲(Max Perutz)和約翰· 肯卓(John Kendrew)這對師生發表了第一對蛋白質血紅素與肌紅素的結構。1962 年諾貝爾化學獎頒給了皤魯茲與肯卓,而同年的醫學獎則頒給了華生與克里克,可以說是結構生物席捲兩大諾貝爾獎的一年。我們通常將1953 年當作是分子生物學(Molecular Biology)開始的一年,而這個領域從一開始便深植了物理的基因。順帶一提,前面介紹的topoisomerase 這類蛋白質最早就是1970 年王倬院士所發現的,他於1982 年當選中央研究院院士,同一年中研院成立分子生物學研究所的籌備處,王倬院士則擔任第一任的籌備處主任。我有幸在2002 年底剛回台灣時,在中研院物理所聽到王倬院士的兩場演講,也聽到他自述他非常喜歡物理與數學,也因此他將他所發現的蛋白質命名為拓樸酶(topoisomerase)。

    結構生物學的另一重要方法是核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR),它相對於前面所提到的X 光晶體學最明顯的優點便是這個方法不需要先得到分子的晶體。有些時候分子結合成晶體的過程中不免會扭曲了分子的構形,甚至於有些分子就是很難找到適合結合成晶體的條件,連運用X 光晶體學的先決條件都達不到。這個時候核磁共振便是值得考慮的作法。核磁共振可決定生物分子在水溶液接近生理狀況的結構,也可以量測溶液中分子間作用的情形。因此,對於篩選先導藥物方面的研究,核磁共振是非常有幫助且快速的技術。核磁共振最早是1938 年伊西多· 拉比(Isidor Rabi)在作分子束的測量時描述到如何測量核磁距的新方法時所提到[7]。這位於以色列出生的美國物理學家,因發現核磁共振現象而獲得1944 年的諾貝爾物理學獎。


    此外,1952 年的諾貝爾物理獎得主:菲力仕· 布洛赫(Felix Bloch)與愛德華· 普賽爾(Edward Mills Purcell),更為核磁共振技術後續發展奠定良好的基礎。大家可看到物理人在核磁共振技術發展史有極大的貢獻。NMR 之所以可以決定出分子的三維結構主要是依賴核歐佛豪澤效應(nuclear Overhauser effect, NOE),這是亞伯特· 歐佛豪澤(Albert Overhauser)在1953 年提出的動態核極化(dynamic nuclear polarization)的理論中預測的效應[8]。將這個效應運用在生物分子三維結構的決定主要是庫克· 維特里希(Kurt Wüthrich)實驗室在2D NOE這個領域的貢獻[9,10],也因此他獲得了2002 年諾貝爾化學獎。非常碰巧,當他接到瑞典打來的得獎通知電話那個時候,剛好在我們中央研究院生物醫學科學研究所的黃太煌老師實驗室訪問。有機會在第一時間分享到他的喜悅,國內從事NMR 領域的老師與學生們也同感興奮。

    參考文獻:
    [1] Arcamone, F., et al. Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from
    s-peucetius var caesius. Biotechnol. Bioeng. 11, 1101-&(1969).
    [2] Tewey, K.M., Rowe, T.C., Yang, L., Halligan, B.D. & Liu, L.F. adriamycin-induced DNA
    damage mediated by mammalian dna topoisomerase-II. Science 226, 466-468(1984).
    [3] Frederick, C.A., et al. Structural comparison of anticancer drug DNA complexes - adriamycin
    and daunomycin. Biochemistry 29, 2538-2549(1990).
    [4] Wu, C.C., et al. Structural basis of type II topoisomerase inhibition by the anticancer drug
    etoposide. Science 333, 459-462(2011).
    [5] Huang, N.L. & Lin, J.H. Recovery of the poisoned topoisomerase II for DNA religation:
    coordinated motion of the cleavage core revealed with the microsecond atomistic
    simulation. Nucleic Acids Research 43, 6772-6786(2015).
    [6] Joshi, D.C. & Lin, J.H. Delineating protein-protein curvilinear dissociation pathways and
    energetics with naive multiple-walker umbrella sampling simulations. J. Comput. Chem.
    40, 1652-1663(2019).
    [7] Rabi, II, Zacharias, J.R., Millman, S. & Kusch, P. A new method of measuring nuclear
    magnetic moment. Phys. Rev. 53, 318-318(1938).
    [8] Overhauser, A.W. Polarization of nuclei in metals. Phys. Rev. 92, 411-415(1953).
    [9] Kumar, A., Ernst, R.R. & Wuthrich, K. A Two-dimensional nuclear Overhauser enhancement
    (2D NOE)experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation
    networks in biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1-6( 1980).
    [10] Herrmann, T., Guntert, P. & Wuthrich, K. Protein NMR structure determination with
    automated NOE-identification in the NOESY spectra using the new software ATNOS.
    J. Biomol. NMR 24, 171-189(2002)

    作者:林榮信
    中央研究院應用科學研究中心
    中央研究院生醫轉譯研究中心 副主任
    智慧醫學專題中心 執行長


     
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